一种不动杆菌及其复合菌剂的应用[发明专利]

*CN102146347A*

(10)申请公布号 CN 102146347 A(43)申请公布日 2011.08.10

(12)发明专利申请

(21)申请号 200910155717.2(22)申请日 2009.12.18(83)生物保藏信息

CGMCC NO.3452 2009.11.16

(71)申请人浙江天科高新技术发展有限公司

地址310012 浙江省杭州市西湖区黄姑山路

9号(72)发明人邱晓力 叶俊英 陈欢 郭红樱(74)专利代理机构杭州求是专利事务所有限公

司 33200

代理人张法高(51)Int.Cl.

C12N 1/20(2006.01)C02F 3/34(2006.01)C12R 1/01(2006.01)C12R 1/125(2006.01)

(54)发明名称

一种不动杆菌及其复合菌剂的应用(57)摘要

本发明公开了一种不动杆菌及其复合菌剂的应用。该菌剂涉及不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJTK-006、枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌共3种菌株，这些菌株经培养后，按其培养物以1∶1∶3的体积比例配比组成微生物复合菌剂，其中不动杆菌ZJTK-006保存编号为：CGMCCNo.3452。本发明制备的菌剂适用于富营养化及高密度养殖水体中的氨氮和叶绿素a的去除处理，能形成良好的微生态体系，促进整体水体生态系统的修复。CN 102146347 A权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页

CN 102146347 ACN 102146349 A

权 利 要 求 书

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1.一种不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJTK-006，其特征在于它是从富营养化养殖塘底泥中分离纯化得到的纯菌株，保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为：CGMCCNo.3452。

2.根据权利要求1所述的一种不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJTK-006，其特征在于所述的不动杆菌ZJTK-006的16SrDNA具有SEQIDNo.1的序列。

3.一种不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJTK-006的应用，其特征在于用于制备微生物复合菌剂。

4.根据权利要求3所述的一种不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJTK-006的应用，其特征在于所述的微生物复合菌剂的制备方法为：将不动杆菌(Acinetobactersp.)ZJTK-006与枯草芽孢杆菌(Bacillus cereus)As 1.1414、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)As 1.2181，经分别培养后，按其培养物以1∶1∶3的体积比例配比均匀混合制成的微生物复合菌剂。

5.一种微生物复合菌剂的应用，其特征在于用于富营养化养殖水体中的氨氮、叶绿素a处理。

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说 明 书

一种不动杆菌及其复合菌剂的应用

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技术领域

[0001]

本发明属于微生物菌剂技术领域，尤其涉及一种不动杆菌及其复合菌剂的应用。

背景技术

近年来，由于城市和工业的迅速发展，以及农业上广泛施用化肥，大量污水排入水体中，使很多水体富营养化。目前，治理水体富营养化的措施主要包括：传统的营养盐控制措施；对外源性污染采取截污、污水改道和污水除磷等；对内源性污染采取清淤挖泥、营养盐钝化、底层曝气和稀释冲刷等一系列措施；化学药品杀藻、机械捞藻等直接除藻措施；以浮游动物、鱼类和水生高等植物控制水体营养盐及浮游植物的生物措施。一些研究者对活性炭吸附、光降解与光催化氧化、臭氧氧化、化学药剂氧化、膜过滤等技术进行了研究，但到目前为止尚无有效应用技术。

[0003] 随着水产养殖业的快速发展及集约化养殖水平的提高，水产养殖病害日趋严重。水产养殖业仍沿袭以往的静水池塘养殖为主，且大部分为高密度单一品种养殖，切断了自然生态体系的食物链循环，养殖对象的残剩饲料、排泄物等大量有机物失去了被其它生物利用的机会，其中的蛋白质及核酸会慢慢分解，产生大量氨等含氮有害物质，过多的氨氮积累引起鱼、虾病害、死亡和水体的富营养化，为养殖业带来巨大的损失。在水产养殖过程中，池塘水体富营养化现象出现频繁，严重的出现水华。例如在虾苗期，投喂的饵料绝大部分不能被虾苗摄食而流失于水体或沉积到池底，在合适的外界环境下，有害藻类就会过量繁殖，最终可能导致水体老化，水生生态结构破坏，病害暴发。 [0004] 水体中存在着大量的微生物，既存在有益微生物也存在有害微生物，有益微生物占据优势则会净化水体，促进水产动物的健康生长。近年来，人们开始尝试在养殖生产中使用有益微生物菌制剂，以改善水体生态环境。目前世界许多国家和地区如巴西、日本、韩国等，对有效微生物群技术在农业、畜牧业和水产养殖上的应用进行了研究。有效微生物群是从自然界筛选出各种有益微生物，用特定的方法混合培养所形成的微生物复合体系，有效降解去除水体中一些有害化因子，维护水体中正常浮游生物的种群数量和结构，使水体自然生态将得到平衡。有效微生物群技术在环保方面的研究工作起步较晚，近几年来逐步开始应用在净化城市生活污水对河流和湖泊的污染及固体废弃物除臭方面。在 养殖水体中应用的如中科院淡水渔业研究中心将光合细菌用于鳗池水质净化和对虾养殖，大连水产学院利用光合细菌净化虾池水质，黑龙江水产所利用光合细菌降解氨氮；仇丽等利用枯草芽孢杆菌改善中华绒螯蟹人工育苗水质。 [0005] 光合细菌施放于池塘中，能消除水体中的氨氮、硫化氢、有机酸等有害物质，改善水体质量，平衡酸碱度，但对于进入水体中的大量大分子有机物质，如养殖动物的排泄物、残存饲料、浮游生物残体等却无法分解利用；而枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等这类菌株，

再进一步矿化生成无机它们能分泌多种胞外酶，把大分子有机物质分解成小分子有机物，

盐类，加快了有机物的分解速度，目前绝大部分养殖业者采用泼洒光合细菌等方法应对，但总的来说产品还有局限性，不够完善。

[0002]

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说 明 书

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水华产生的主要原因是水质富营养化，我们从富营养化虾塘底泥中分离纯化出一株不动杆菌菌株，与光合菌、芽孢菌复合制备一种包含多种高效活菌的复合微生物菌剂，可有效降解或去除水体中一些有害化因子，维护水体中正常浮游生物的种群数量和结构，使水体自然生态得到平衡，是治理湖泊、养殖水体的一种比较有效的方法，同时微生物制剂具有投加量小，操作简便，无毒副作用及经济合理等特点，可以较低的成本有效地抑制藻类的生长，使水体透明度提高，防止水华的发生。 发明内容

[0007] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种不动杆菌及其复合菌剂的应用。 [0008] 不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJTK-006是从富营养化养殖塘底泥中分离纯化得到的纯菌株，保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日为2009年11月16日，保藏编号为：CGMCCNo.3452。

[0009] 所述的不动杆菌ZJTK-006的16SrDNA具有SEQIDNo.1的序列。不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJTK-006用于制备微生物复合菌剂。所述的微生物复合菌剂的制备方法为：将不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJTK-006与枯草芽孢杆菌(Bacilluscereus)As 1.1414、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)As 1.2181，经分别培养后，按其培养物以1∶1∶3的体积比例配比均匀混合制成的微生物复合菌剂。微生物复合菌剂用于富营养化养殖水体中的氨氮、叶绿素a处理。

[0010] 枯草芽孢杆菌(Bacillus cereus)As 1.1414及沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)As 1.2181来源于中国普通微生物菌种保藏中心。 [0011] 本发明与现有技术相比具有的有益效果

[0012] 本发明的不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJTK-006CGMCCNo.3452、枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌分别按各自的培养条件进行培养，然后按1∶1∶3的体积比例配比均匀混合制成的微生物复合菌剂，能够适应高密度养殖富营养化水体的氨氮处理。这些菌株单独使用时，虽然具有一定的去除氨氮能力，但是效果不是很明显，本发明由于菌株之间具有协同互补作用，产生了与其单独作用意想不到的效果，同时比枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌混合使用时的去除氨氮、叶绿素a效果更好。微生物复合菌剂可使水体中的菌相与藻相达到平衡，维持稳定良好水质条件，使富营养化氨氮养殖水体得到净化处理，还有一定的去除叶绿素a的作用，对富营养化水体叶绿素a含量的降低和水体透明度的提高有明显的效果。

附图说明

[0013] 图1为不动杆菌ZJTK-006革兰氏染色照片；

[0014] 图2为不动杆菌ZJTK-006CGMCCNo.3452的电镜照片； [0015] 图3为实施例5水体氨氮变化趋势；

[0016] 图4为实施例5水体叶绿素a变化趋势。

具体实施方式

[0017] 不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJTK-006是从富营养化养殖塘底泥中分离纯化得

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说 明 书

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到的纯菌株，保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日为2009年11月16日，保藏编号为：CGMCCNo.3452。

[0018] 所述的不动杆菌ZJTK-006的16SrDNA具有SEQIDNo.1的序列。不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJTK-006用于制备微生物复合菌剂。所述的微生物复合菌剂的制备方法为：将不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJTK-006与枯草芽孢杆菌(Bacilluscereus)As 1.1414、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)As 1.2181，经分别培养后，按其培养物以1∶1∶3的体积比例配比均匀混合制成的微生物复合菌剂。微生物复合菌剂用于富营养化养殖水体中的氨氮、叶绿素a处理。

[0019] 枯草芽孢杆菌(Bacillus cereus)As 1.1414及沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)As 1.2181来源于中国普通微生物菌种保藏中心。 [0020] 实施例1

[0021] 分别采集富营养化养殖塘水体及底泥，接种到液体基础培养基中，于32-35℃，摇床转速150r/min下培养2天，以水体中的氨氮值为指标，将氨氮降低明显的液体培养混合微生物稀释涂布于固体基础培养基上，以上操作重复二次，挑取长势良好的单菌落，作为初筛菌。将初筛菌株接种在液体分离培养基 中，于32-35℃，摇床转速150r/min下进行培养3-4天，测定MC-LR的含量，确定菌株降解MC-LR的能力强弱，挑选氨氮降低明显同时又对MC-LR具有一定降解作用的菌落划单菌落纯化两次，即得到所筛选菌株ZJTK-006。 [0022] 基础培养基：Na2HPO42.4g，KH2PO42.6g，NaCl0.328g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.013g，NH4Cl1.0g，葡萄糖2g，加水溶解，补充蒸馏水至1000ml，PH7.2-7.5(固体需加2％琼脂)。

[0023] 分离培养基：Na2HPO42.4g，KH2PO42.6g，NaCl0.328g，MgSO4·7H2O0.5g，CaCl2·2H2O0.013g，MC-LR0.005g，加水溶解，补充蒸馏水至1000ml，PH7.2-7.5。 [0024] 培养温度：32-37℃，适宜温度32-35℃，震荡培养。 [0025] 实施例2

[0026] 本发明分离出一株不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJTK-006，根据其形态特征及基于16SrDNA序列的系统进化分析对其进行鉴定。其特征在于它是从富营养水塘底泥中分离纯化得到的纯菌株，其16SrDNA具有SEQIDNo.1的序列，保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为：CGMCCNo.3452。 [0027] (1)不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJTK-006的形态及理化特征

形态特征：

[0029] 近球形短杆菌，0.5-1.0μm×0.6-1.6μm，不产芽孢，革兰氏染色阴性，偶尔脱色困难，(见图)；菌落呈乳白色，圆形，边缘整齐。 [0030] 理化特征：

[0031] 该菌株专性好氧，接触酶阳性，氧化酶阴性，不能进行葡萄糖发酵，不能利用乙醇发酵，

[0032] V.P.试验阳性，不具运动性，明胶水解阴性，柠檬酸盐利用阳性，葡萄糖产酸阴性，丙二酸盐阳性，L-苯丙氨酸阳性，化能异养。 [0033] 依据《伯杰细菌分类手册》提供的鉴定方法和上述试验结果表明，可初步判定为不动杆菌属的菌株。

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说 明 书

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(2)16S rDNA序列的系统进化分析 [0035] 测定不动杆菌16S rDNA部分序列。

[0036] 下表在本发明所述的依据不动杆菌序列从GeneBank中调出的部分相关菌株的16SrDNA序列的登录号。

[0037]

Acinetobacter genomosp

Acinetobacter alcoaceticus Acinetobacter sp.

Acinetobacter rhizosphaerae Acinetobacter baumannii

[0038]

序列登录号 FJ694759.1 EF432578.2 GQ245971.1 DQ536511.1 FJ867355.1

相似度(％) 99 99 99 99 99

结合上述形态特征及16S rDNA序列分析，可以确定该菌为不动杆菌属，分离到的

菌株为不动杆菌ZJTK-006。不动杆菌ZJTK-006的16SrDNA具有SEQIDNo.1的序列，该序列已提交到GenBank数据库，登录号为：GU201827。 [0039] 实施例3

[0040] 枯草芽孢杆菌培养条件： 培养基：牛肉膏10g/L，蛋白胨5g/L，NaCl10g/L，PH 7.2-7.5， [0042] 培养温度：32-35℃恒温震荡培养。 [0043] 沼泽红假单胞菌培养条件： [0044] 培养基：丙酸钠1.0g，硫酸铵1.0g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.5g，酵母膏0.1g，水1000ml，PH6.5-7.2 [0045] 培养温度：33-35℃，光照3000Lx，静止培养5-7天。 [0046] 微生物复合菌剂制备：

[0047] 菌株不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJTK-006与枯草芽孢杆菌(Bacillus cereusAs.)1.1414、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)1.2181，按照培养基配方分别接种于各自的培养基，分别培养使各菌的菌数≥1.0×109cfu/ml，按其培养物以1∶1∶3的体积比例配比均匀混合组成一种微生物复合菌剂。 [0048] 实施例4

[0049] 进行南美白对虾水产应用试验，养殖塘选长方形高位虾塘4个，试验面积10亩/塘，平均水深1.4米，最深处为1.8米左右，每亩放养8万尾，规格0.7-0.8cm，各池配水车式增氧机，平均水温28℃。

[0041]

养殖塘分两组，试验组两个塘，对照组两个塘。试验组使用复合微生物菌剂，浓度≥1.0×109cfu/ml。按0.5Kg/亩的剂量添加，用养殖水稀释，搅拌均匀后，全池泼洒，每7天泼洒1次，连续4次。对照组不使用复合微生物菌剂，添加光合菌，使用菌浓度相同，其余养殖条件均相同。取试验前后水样检测，结果对照组氨氮下降23.3％，试验组氨氮下降65.6％，超过对照组42.3％。同时使用复合微生物菌剂能明显改善南美白对虾养殖水体的水质，保持水体益生菌种群 数量，使养殖水体透明度好，水色清澈透爽。 [0051] 实施例5

[0050] [0052]

进行罗氏沼虾养殖试验，试验分3个塘，每个虾塘约3.5亩，平均水深1.4米。设

对照组，试验1组添加光合菌、枯草芽孢菌(活菌总数≥1.0×109cfu/ml)，试验2组添加复合微生物菌剂(有效活菌总数≥1.0×109cfu/ml)。按1Kg/亩的剂量添加菌剂，用养殖水

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说 明 书

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稀释40倍，在虾塘内全池泼洒。试验期为2个月，约20天取一次水样测定(均在泼洒菌剂前取水样)。结果添加试验1组与对照组水体氨氮变化差异不大，均而试验2组即添加复合微生物菌剂组，水体氨氮下降74％，超过对照组及试验1组20％左右，效果明显；养殖水体中对照组叶绿素a上升9％，试验1组叶绿素a下降23％，试验2组叶绿素a下降57％，结果表明添加试验1组的叶绿素a降解比对照组明显下降，而添加复合微生物菌剂组比试验1组效果更好。使用复合微生物菌剂的池塘水体透明度增加，有害藻类明显减少，从而使养殖过程达到环保、绿色、无公害的养殖标准。(见图3、图4) [0053] 实施例6

[0054] 取景观池塘一个，池塘总面积约400m2左右，平均水深1.5m，按0.5Kg/亩·米添加复合微生物菌剂(有效菌数≥1.0×109cfu/ml)，全池泼洒，以添加复合微生物菌剂前取水样，及隔10天后取水样，检测理化指标。施放复合菌剂后，水体中的氨氮、叶绿素a明显降低，处理后水体中的氨氮浓度从1.40mg/l到0.36mg/l，去除率74.3％；处理后水体中的叶绿素a浓度为27.3mg/m3，下降71.4％，使藻类基本得到控制，提高水体的透明度，说明添加复合微生物菌剂也可净化景观水体。 [0055] SEQIDNo.1的序列为： [0056] <110>OrganizationName：浙江天科高新技术发展有限公司 [0057] <120>Title：一种不动杆菌及其复合菌剂的应用 [0058] <212>Type：DNA [0059] <211>Length：1500 [0060] SequenceName：ZJTK006 [0061] <213>OrganismName：Acinetobacter sp. [0062] <400>PreSequenceString：

[0063] agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ttaacacatg caagtcgagc 60 [00] gggggaaggt agcttgctac tggacctagc ggcggacggg tgagtaatgc ttaggaatct 120 [0065] gcctattagt gggggacaac atctcgaaag ggatgctaat accgcatacg tcctacggga 180 [0066] gaaagcaggg gatcttcgga ccttgcgcta atagatgagc ctaagtcgga ttagctagtt 240 [0067] ggtggggtaa aggcctacca aggcgacgat ctgtagcggg tctgagagga tgatccgcca 300 [0068] cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca 360 [0069] atgggcgcaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggccttat ggttgtaaag 420 [0070] cactttaagc gaggaggagg ctactttaga taatacctag agatagtgga cgttactcgc 480 [0071] agaataagca ccggctaact ctgtgccagc agccgcggta atacagaggg tgcaagcgtt 540 [0072] aatcggattt actgggcgta aagcgcgcgt aggcggctaa ttaagtcaaa tgtgaaatcc 600 [0073] ccgagcttaa cttgggaatt gcattcgata ctggttagct agagtgtggg agaggatggt 660 [0074] agaattccag gtgtagcggt gaaatgcgta gagatctgga ggaataccga tggcgaaggc 720 [0075] agccatctgg cctaacactg acgctgaggt gcgaaagcat ggggagcaaa caggattaga 780 [0076] taccctggta gtccatgccg taaacgatgt ctactagccg ttggggcctt tgaggcttta 840 [0077] gtggcgcagc taacgcgata agtagaccgc ctggggagta cggtcgcaag actaaaactc 900 [0078] aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc 960 [0079] gaagaacctt acctggcctt gacatagtaa gaactttcca gagatggatt ggtgccttcg 1020

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说 明 书

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ggaacttaca tacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080

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说 明 书 附 图

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图1

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说 明 书 附 图

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图3

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