卞圈 才２０１３・１４ Ｂ０ＴＵＩ ＩＮＵＭ ＯＬＵＭＮ 国 肉毒杆菌检测与控制技术研究进展 刘继超，姜铁民，陈历俊 （北京三元食品股份有限公司，北京 ｌ０００７６） 中图分类号：ＴＳ２５２．７文献标识码：Ａ文章编号：１００４—４２６４（２０１３）１４—０００７—０４ 摘要：肉毒杆菌是一种只能在厌氧条件下生长的细菌，大量繁殖分泌的肉毒毒素是迄今为止所发现的生物 毒素中毒性最强的物质之一。本文就该菌的生物学特征、临床感染症状、最新研究进展、生产控制与产品检 验等方面进行阐述，以便使广大奶业从业者及消费者对其有全面的认识。 关键词：肉毒杆菌；肉毒毒素；生物学特性；临床症状；检测 肉毒梭状芽孢杆菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）简称 １．１ 肉毒杆菌 肉毒梭菌或肉毒杆菌，是一种只能在厌氧条件下生长的 肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽孢杆菌属，具有该菌属 细菌，在日益普及的真空包装、冷冻食品及罐装食品中 的基本特性，即厌氧性的杆状菌，形成芽孢，芽孢比繁 具有生长优势，其低温生长所产生的毒素是发生这类食 殖体宽，呈梭状，新鲜培养基的培养物革兰氏染色为阳 品中毒的主要原因之一。肉毒杆菌大量繁殖时所分泌外 性，产生剧烈细菌外毒素——肉毒毒素。肉毒梭茵为多 毒素为肉毒毒素（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕ ｒｏｔｏｘｉｎｓ，ＢｏＮＴｓ）， 形态细菌，约为４ ｕ ｍ Ｘ １ ｍ的大杆菌，两侧平行，两 是目前已知毒性最强的生物毒素之一，成人致死量为 端钝圆，直杆状或稍弯曲，芽孢为卵圆形，位于次极端 ３］，常见很多游离芽孢，有时形成长丝 ０．１ ｕ ｇ【Ｊ’ 。肉毒中毒属食物中毒性疾病，是单纯的中 或偶有位于【毒，而非传染病。该中毒事件在世界各地都有发生，但 状或链状，有时能见到舟形、带把柄的柠檬形、蛇样线 ４］。当菌体开始 不常见。２０１３年８月３日，全球最大的乳制品加工企业 状、染色较深的球茎状，这些属于退化型＿新西兰恒天然集团对外宣布，旗下部分产品可能含有肉 形成芽孢时，常常伴随着白溶现象，可见到阴影形。肉 毒杆菌，受污染的乳制品产品可能被用于婴儿配方奶 毒梭菌具有４～８根周生性鞭毛，运动迟缓，没有荚膜 ｊ。 粉、成长奶粉和运动型饮料的生产，影响包括３个中国 在固体培养基表面上，形成不正圆形，大约３ｍｍ 企业在内的８家客户。这一震惊全世界的消息再次使肉 的菌落。茵落半透明，表面呈颗粒状，边缘不整齐，界 毒杆菌及毒素走进了大众的视线，８月９日北京国家质检 线不明显，向外扩散，呈绒毛网状，常常扩散成茵苔。 总局计划将肉毒杆菌加入进口奶粉的必检项目，本文就 在血平板上，出现与茵落几乎等大或者较大的溶血环。该菌的生物学特征、临床感染症状、最新研究进展、生 在乳糖卵黄牛奶平板上，菌落下培养基为乳浊，菌落表 产控制与产品检验等方面进行阐述，以便使广大奶业从 面及周围形成彩虹薄层，不分解乳糖；分解蛋白的菌 业者及消费者对其有全面的认识。 株，菌落周围出现透明环。 肉毒梭菌芽孢一般于１ ５℃开始发育，适宜生长 １生物学特征 和产生毒素温度为２５～３５℃，培养基的最适ＰＨ为 ６．０～８ ２。其所有菌株在４５℃以上都受到抑制，８０ｏＣ经 ２０ｍｉｎ可被杀死，但其芽孢的耐热力很强，干热１ ８０。ｃ 收稿日期：２０１３—０８—１３ 作者简介：刘继超（１９８３一），男，硕士，研究方向为乳品微生物。 通讯作者：陈历俊（１９６７一），男。教授级高级工程师，研究方向为乳 品科学。 ５～１５ｍｉｎ可杀死芽孢。分解蛋白型的肉毒梭菌芽孢比 圈 卞Ｂ圈０觚Ｔ才Ｕ ２Ｉ ０１Ｉ ３・Ｕ１４Ｍ Ｃ（）１ Ｕ ｝Ｎ 非蛋白分解型的肉毒梭菌芽孢对热具有更强的抵抗力， 如分解蛋白的Ａ型肉毒梭茵芽孢加热１００ｏＣ ３６０ｍｉｎ或 １２０℃４ｍｉｎ方可被灭活，而分解糖的Ｅ型肉毒梭菌芽孢 ８０￣Ｇ ２０ｍｉｎ就能被杀灭。 ２临床感染症状 肉毒中毒的潜伏期一般为１ ２～３６ｈ，一般发病在 ３－４ｄ，有些患者突然出现神经肌肉麻痹等神经系统症 状，给临床诊断带来困难ｌＪ 。临床症状早期主要表现 １．２ 肉毒毒素 肉毒毒素是肉毒梭菌产生的外毒素，根据其抗原性 为复视、构音困难和吞咽困难，可以引起急性四肢对称 的不同分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ７种血清型ｌ６’ ，其中 性弛缓性瘫痪伴有显著的延髓麻痹，严重者发生呼吸衰 自然存在的Ａ、Ｂ、Ｅ和Ｆ型毒素能够造成人类中毒，Ｃ、 Ｄ型则常引起动物中毒，Ｇ型引起人类中毒的报道较少ｌ８］。 Ａ型毒性最强，其小鼠致死剂量介于０ １～１ｎｇ／ｋｇ，而低达 ０．１—１ ｕ ｇ的毒素就可导致成人中毒死亡，其毒性是有 机磷类神经毒剂沙林的１ ０万倍。 肉毒毒素在酸性条件下比较稳定，对碱反应比较 敏感，易被碱和热破坏，暴露于日光下亦可迅速失去 毒力。Ａ型肉毒毒素经６０ｏＣ加热２ｍｉｎ，几乎完全被破 坏，而Ｂ、Ｅ－－型毒素要经７０￣Ｃ￣ＪＥＩ热２ｍｉｎ才能被破坏， Ｃ、Ｄ二型毒素对热的抵抗更强，Ｃ型毒素要经过９０℃ 加热２ｍｉｎ才能完全破坏。但是，只要煮沸１ ｍｉｎ或７５℃ 加热５～１ ０ｍｉｎ各型毒素都能被完全破坏。 １． 婴儿肉毒中毒 肉毒中毒根据发生的途径可将其分为３种不同的类 型：食物携带型中毒、创伤型中毒和婴儿肉毒中毒旧】。 其中婴儿肉毒中毒最为普遍。 婴儿一旦摄取含有梭状肉毒杆菌芽孢的食物，就很 可能会引起肉毒中毒。和年龄稍大的孩子和成人不同， １岁以下的婴儿体内还没有形成完好的肠道菌群——优 质菌群来抵抗肉毒杆菌芽孢的侵袭。当宝宝摄取了被污 染的食物之后，肉毒杆菌芽孢就会立刻攻占肠道，芽孢 本身没有毒，但会在婴儿的肠内发芽，释放肉毒杆菌毒 素，随即进入血液，从而导致神经麻痹［ Ｊ１１］ｏ到了１２个 月左右，宝宝体内渐渐形成与成人相似的肠道菌群，就 可以有效地阻隔梭状肉毒杆菌。因此，应鼓励母乳喂 养，预防婴儿型肉毒中毒的发生。研究表明，婴儿在经 历营养变更的时候，也容易引发肉毒中毒，比如由母乳 转为配方奶粉喂养，或者在添加辅食的时候。 婴儿肉毒中毒的治疗是帮助通气呼吸、维持营养等支 持疗法，给予抗生素和抗毒素不但无效，可能还有害。因 为使用抗生素后可致肠内大量的肉毒杆菌突然死亡，导致 毒素释放并在短期内被大量吸收，从而加重病情。 竭，直至死亡 伯＇¨］。特异性症状可分为４组：（１）眼 部症状：眼睑下垂，视物模糊，复视，斜视。Ａ型肉毒 杆菌毒素中毒远视差、近视正常，Ｂ型则相反；（２）口 舌咽部症状：张１：３困难，咀嚼无力，伸舌困难，言语不 清，构音不良； （３）吞咽困难：咽部紧缩感，呛咳， 流涎；（４）肢体及呼吸肌麻痹：抬头困难，四肢软 瘫，尿潴留，呼吸困难，呼吸衰竭 。肉毒中毒的死亡 率较高，一般为２０％～４０％。 ３检测方法 肉毒毒素中毒的临床诊断主要是依据临床体征和主 述分析，实验室检测肉毒杆菌及毒素与定性对确诊和治 疗具有重要意义，到目前为止经典的小鼠致死及中和试 验仍是最敏感、最可信的肉毒检测方法，该方法经过不 断完善，甚至可以对很微量的毒素做到定量检测。但该 方法比较繁琐、耗时。不易推广，因此人们不断探索一 些更简便、更快捷、更灵敏的新方法。随着免疫学和 现代分子生物学技术的不断发展，许多新技术被广泛 应用于肉毒梭菌的检测中，主要包括毒素免疫血清检 测和ＰＣＲ基因检测等 ，仃］。 ３ １ 免疫学检测法 免疫学检测法（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＩＡ）是利用抗原 抗体反应检测标本中微量物质的方法，是目前肉毒毒素 检测领域应用最为广泛的检测方法，主要包括反向间接 血凝法（ＲＰＨＡ）、反向乳胶凝集实验（ＲＰＬＡ）、毛细 管扩散及更加灵敏的凝集试验、放射免疫法（ＲＩＡ）和 酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ），各种免疫学方法检测肉毒 毒素的比较见表１。Ｍｉｌｅｓ等”。 使用单克隆抗体的ＥＬＩＳＡ 检测肉毒毒素，建立了一个快速检测肉毒毒素Ａ、Ｂ前 体ＨＡ７０１￣０ＥＬＩ，ＳＡ夹心法，显示良好的结果。在大多数 食物样品中很容易检测￣ｌＪ２ｎｇ／ｍＬ的Ａ、Ｂ、Ｅ￣Ｉ：ＩＦ型肉毒 神经毒素。免疫学检测法通常可在１个工作日内完成， 国 中ｌ ｛圈（） Ｆ冲ＬＴｌ２Ｉ ０１ ３・Ｕ１４Ｍ ０ｌ ＵＭ ２ ３ ４ ５ ６作为必检项目。但恒天然“肉毒杆菌”事件之后，２０１３ 年８月９日国家质检总局已要求各地检验检疫机构加强对 【１（）Ｊ Ｍａｈａｊａｎ ＳＴ，Ｂｒｕｂａｋｅｒ Ｌ Ｂｏｍｌｉｍｎｎ ｔｏｘｎ１：ｆｒｏｍ ｌｉｆｅ—ｔｈｒｅａｔｅｎｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｏ ｎｏｖｅｌ ｍｅｄｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］Ａｉｎ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ，２００７， １９６（１１：７—１ ５ 新西兰输华乳制品的检验监管，或要求进口奶粉企业出 具“肉毒杆菌”的检测报告，以保证国内乳粉市场的安 【１ １ Ｊ Ｄｕｔｔｏｎ ＪＪ，Ｆｏｗｌｅｒ ＡＭ Ｂｏｔｎｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ ｉｎ ｏｐｈｔｈａｌｎ１０１（ ｇｙＵ】 Ｓｕｒｖ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏ１．２０（）７ ５２（１）：１３—３１ 全和消费者的身体健康。 ５ 结滔 肉毒杆菌存在于土壤、淤泥、尘土和动物粪便中， 在无氧环境中可产生外毒素，称为肉毒毒素，土壤中肉 毒杆菌检出率较高的、青海、宁夏以及等地是 肉毒中毒次数发生最多的省区。当人们摄入了含有一定 量肉毒毒素的食物时，就会发生肉毒中毒，其中婴儿肉 毒中毒最为普遍。虽然肉毒毒素的致病性很强，但是通 过加热、光照等方法可以将其杀灭，有效地保障人们的 身体健康。当然，随着现代高新技术和检测方法的研究 和发展，人类将开发出能更有效地杀死或控制肉毒杆菌 及其毒素的新技术和新产品，来控制肉毒杆菌的生长和 中毒事件的发生。 参考文献 １）ｅｎａｂｅｋ ＺＦ，Ｓｍｉｔｈ ＬＡ，Ｒｕｓｎａｋ ＪＭ Ｂｏｔｕｌｉｓｍ：ｃａｕ ｓｅ，ｅｆｆｅｃｔｓ， ｄｉａｇｎｏ ｓｉｓ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｒｅａｔｎｌｅｎｔ ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ［［】Ｄｉｓａｓｔｅｒ Ｍｅｄ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｅｐ，２００７，１：１２２． Ｚｈｏｕ ＹＰａ，ｔｕｒｉ Ｓ，Ｌｉｎｄｏ Ｐ，ｅｔ ａｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｔｍｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈ ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｌｌｙ ａｃ ｒｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｅｎ１ａｇｇｌｕｔｉｎｌｎ一３３，ｔｙｐｅ Ａ ｂｏｔｎｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ａ ｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕ】Ｐｒｏｔｅｉｎ，２００７，２６（１）：２９—３７ 牛天贵食品微生物学实验技术［ＭＩ．北京：农业大学出版社， ２（）（）３：３９５－３９６ 郑玉玲，雷柞反向乳胶凝集法快速检测肉毒Ａ，Ｂ型毒素 中 国公共卫生，１９９５，１ ２（１）：３３—３４ 付留杰，李晓风．肉毒中毒及其防治现状Ｌ１］．前卫医药杂志， １９９５，１２（２）：１１８—１ １９ Ｊａｃｏｂｓｏｎ ＭＪ，Ｌｉｎ Ｇ，Ｗｈｉｔｔａｍ ＴＳ，ｅｔ ａｌ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｍｌｉｎｕｎｒ ｔｙｐｅ Ａ ｂｙ ｎｍｌｔｉ—ｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｉｎｇ［［Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０（）８，１５４（８）：２４０８—２４１５． Ｇｉｎａｌｓｋｉ Ｋ，Ｖｅｎｃｌｏｖａ ｓＣ，ＬｅｓｙｎｇＢ，ｅｔ ａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ—ｂａｓｅｄ ｓｅｑｎｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐ—ｔｒｅｆｉｉｆｌ ｓｕｂｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｒｅｓｉｄｕｅ ｌｅｖｅｌ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ［ＪＪ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，２０００，４８（２）：１１９ １２４ Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｋ，Ｆｏｘ ＭＤ，Ｃｏｒｉｎｎｅ Ａ，ｅｔ ａｌ Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｉｎｆａｎｔ ｂｏｔｕｌｉｓｍ…．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ，２００５，３２（３）：１４９—１５４ Ｍｏｎｔｅｃｕ ＣＣＯ Ｃ，Ｓｃｈ１ａｖｏ Ｇ，Ｔｕｇｎｏｌｉ Ｖ，ｅｔ ａｌ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［［］ Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ，１９９６，２（１（））：４１８ １０ 【１２】Ｆｏｒｓｓ Ｎ，Ｒａｍｓｔａｄ Ｒ，Ｂ ｃｋｌｕｎｄ Ｔ，ｅｔ ａｌ １）ｉｆｉｃｕｌｔｉｅｓ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ ｆｏｏｄ—ｂｏｒｎｅ ｂｏｔｕｌｉｓｍ［ＪＪ Ｃａｓｅ Ｒｅｐ Ｎｅｕｒｏｌ，２０１ ２，４：１ １ ３ 【１ ３］Ａｒｎｏｎ ＳＳ，Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ Ｒ，ｌｕｇｌｅｓｂｙ ＴＶ，ｅｔ ａｌ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｎｌ ｔｏｘｉｎ ａｓ ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｗｅａｐｏｎ：ｎ１ｅｄ１ｃａｌ ａｎｄ ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔＵ】． ＪＡＭＡ，２（）（）１，２８５：１０５９ 【１４］杨继荣，李泽纯，张岩伟肉毒杆菌中毒７例分析【Ｉｌ现代诊断与 治疗，２０（）（），１１（６）：３７５ ［１５１田红，邹晗肉毒杆菌中毒２１例临床分析Ｕｊ中华临床医学研究 杂志，２００６ １２：２２２８． ［１６１张雪平肉毒毒素生物学活性及肉毒ｑ－毒病原检测方法的研究 进展Ⅱ１中国生物制品学杂志，２（１（）９，２２（７）：７２８—７３３ ｌ１ ７】Ｃｈａｏ ＨＹ，Ｗａｎｇ ＹＣ，Ｔａｎｇ ＳＳ，ｅｔ ａｌ Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｎｎｌｌｕｎｅ— ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｃｌｏ ｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｎ］ ［１８］ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ｔｙｐｅ ＡＬｌ】Ｔｏｘｉｃｏｎ，２００４，４３（１）：２７ ３４ Ｍｉｌｅ ｓ ＣＳ，Ｌｕｉ ｓ ａ ＷＣ，Ｋａｔｈｒｙｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ Ｄ ｅｖｅｌｏＰＩ１］ｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｘ Ｍｏｎｏ ｃ１ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ ｔｏ Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ一７０ ｏｆ Ｃｌｏ ｓｔｒｉｄｉｕＩＩ１ ｂｏｔｕｌｉ１１ｕｎｌ 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