小反刍兽疫病毒F基因的序列分析

ProressinVeterinaredicinegyM

小反刍兽疫病毒F基因的序列分析

()西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌７宁夏动物疾病预防控制中心,宁夏银川７１．１２１００;２．５００１１

２

,周海宁１,尹　才２,马　龙２,王晶钰１∗

为弄清宁夏某羊场山羊感染的小反刍兽疫病毒(以宁夏某山羊养殖　　摘　要:PPRV)F基因的分子特征,

场采集的疑似小反刍兽疫病毒(的病料为试验材料,提取病料R扩增P阳性样品进PPRV)NA,PRVＧF基因,行序列分析和系统进化树分析.同时,对该基因编码的F蛋白进行生物信息学分析,预测该蛋白的结构及理化特性.结果表明,成功扩增了P与预期大小相符,经测序及序列比对,证实获得病料为小PRVＧF基因,反刍兽疫病毒(阳性;系统进化分析表明,宁夏鉴定的PPPRV)PRV与中国其他省份报道的８个毒株及印度、蒙古等国报道的７个毒株同属谱系Ⅳ;生物信息学分析显示,该蛋白为疏水蛋白,有信号肽、跨膜区.通同时,对P为进一步研究该蛋白的生物学功能,研制基因工程PRVＧF基因编码的F蛋白的生物信息学分析,疫苗奠定基础.

小反刍兽疫病毒;克隆;序列分析　　关键词:F基因;

中图分类号:S８５２．７２３

文献标识码:A

()文章编号:１００７Ｇ５０３８２０１８１１Ｇ００１９Ｇ０６

过对宁夏分离病料的P提示宁夏感染的PPRVＧF基因分析,PRV与中国其他省份分离的PPRV毒株同源;

,引起的一种急性、高度接触性传染病,virusPPRV)能够感染山羊、绵羊和野生小反刍兽等动物,以发热、口腔及舌黏膜糜烂、流泪、流鼻液、腹泻和肺炎等症状为主要特征

[１]

,　　小反刍兽疫(PestedespetitsruminantsPPR)是由小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminants

本研究以宁夏地区采集的疑似PPR的病料为研究

对象,提取样品RNA,RTＧPCR扩增PPRVＧF基因,通过分子鉴定验证该病料是否为P同时,PRV阳性;通过对本研究获得的F基因进行生物信息学分析,阐明宁夏感染的PPRV的谱系以及F蛋白的分子特征,为进一步探索该病毒在不同地理区域间的传播情况,研究该基因的功能,制备亚单位疫苗奠定基础.

.

PPRV为有囊膜的多形性单股负链RNA病毒,含有１５９４８个核苷酸.该基因共编码６种结构蛋这两种蛋白可在感染后激起机体保护反应.F和H,

其翻译产PPRVF基因与所有副黏病毒一样,物F蛋白裂解后产生的F０蛋白无活性,１和F２才

]３

.研究显示,具有活性[PPRVＧF基因编码的融合

还有２种外部蛋白N蛋白、M蛋白、P蛋白、L蛋白,

]２

.其中６种结构蛋白依次为白和２种非结构蛋白[

１　材料与方法

１．１　材料

１．１．１　病料　本试验所用病料由宁夏动物疾病预防控制中心于２０１６年采集.该病料来源于宁夏回族自治区银川市西夏区某发病山羊养殖场,根据临床症状及剖检变化,初步判断为小反刍兽疫疑似病例,采集该发病山羊淋巴结、肝、脾脏等组织带回实验１．１．２　主要试剂　TransScritoneＧsteTＧPCRppR

病毒SuerMIX购自全式金生物技术有限公司;p核酸RNA提取试剂盒购自苏州天隆科技有限公司;

分子标准购自北京天根生化科技有限公司.室,置－７０℃保存.

蛋白(是决定病毒感染细胞的关键,具有诱F蛋白)导产生细胞溶血素、促进细胞融合以及启动病毒感染细胞等生物学活性.当前,PPR尚无有效治疗方有研究显示,F蛋白在麻疹病毒属中是主要的保护

４]

.另有研性免疫原,能够诱导机体产生中和抗体[

式,主要通过早期诊断和疫苗免疫的方式进行控制.

究报道,不同地区来源PPRVＧF基因毒株谱系不同,通过对F基因核苷酸序列进行分析,可以为该病毒

５Ｇ６]

.因此,在不同地理区域间的传播途径提供线索[

１．２　方法

１．２．１　PPRV总RNA的提取　取２mg发病羊组

　收稿日期:２０１７Ｇ１１Ｇ２７

:[)基金项目宁夏回族自治区科技支撑计划宁农科(　２０１６４号]

,周海宁(女,宁夏西吉人,硕士,高级兽医师,主要从事动物疫病监测和流行病学调查.∗通讯作者　作者简介:１９８３－)

２０

动物医学进展　２总第３０１８年　第３９卷　第１１期(０５期)

织样本,加入石英砂,用无菌无核酶研钵充分研磨,,加入无核酶P制成１∶５~１∶１BS(H７．４)０悬液,p/,液氮反复冻融３次,取上清８０００rmin离心２min液备用.用RNA提取试剂盒提取上清液样品中病置－８RNA测定浓度及纯度,０℃保存备用.１．２．２　引物的设计与合成　根据GenBank中公布毒总R具体步骤参考试剂盒说明书.提取的总NA,

、登录号:登录号:Benin(KR７８１４５０．１)Ghana(

)、、登录号:KJ４６６１０４．１Nieria(EU２６７２７４．１)westg、Om登录号:KM登录号:a(４６３０８３．１)an(y

)、).用MA登录号:KJ８６７５４４．１UAE(KJ８６７５４５．１Ｇ分析本试验获得GA５．１构建PPRVＧF基因进化树,

的样品与其他地区分离株的亲缘关系.

１．２．６　PPRVＧF基因编码氨基酸序列分析及F蛋白结构预测　应用生物信息学方法,通过网络服务器(、登录号:登录号:AfricaKP７８９３７５．１)Cotedlvire(

)、(、登录号:EU２６７２７３．１UandaKJ８６７５４３．１)KenＧg

物,其中上游引物(FＧf)为:５′ＧATGAＧ

的K登录号:urdistan株PPRVＧF基因序列(

),用PKF６４８２８７rimerPremier５软件设计１对引

为A:C期扩增的片５G′ＧGCGTTACCG段AC大GATA小GTACTTCTTGCAAＧ３C′;下游引物(GTACFＧr).预海)贸易有限公司合１６成４,１b用dp,引物由英GA潍CＧ捷３′基(上稀释,置－dH２O按１０pmol/２０℃保存备用.

μL总．２R．３　PNAP为RV模ＧF基因的板,使用TRrTaＧnPsCScR扩增ripton　以eＧstePPRTV

Ｇ系如下CRSu:p在er２M０ix进行一步法μL的反应体R系T中ＧP加CR扩增.p反应体R入２×OneＧStepMeNiax０ctioA模．４n板μMLix,２１１００pμ加mL,o灭lT/r菌μ

aLnsS上cr、ip下tO游n引eＧS物te各p水水补至２０En．４zy

μmLe,:物于０s４５,７℃反转录μL,１２０℃,２０min９４℃５min９０４μ℃L.反应条

件;;３０s,５.４℃

产g/９L０s琼脂３５个循环;糖凝胶中７电２℃终延伸泳,观察和１０记m录in

结果.将目的条带切胶回收纯化后,送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序.

．２．４　PP入R到VＧ(GF基因的核苷酸序列分析enBank数据库中进行同　将获得的

序列,输源性比较得的病料是否为http://blast．ncb．２．５　PPRVＧFPi基P．n因Rlm．Vn/),验证获阳性样品ih．govB.

last．cg

i进化树分析　从GenBank中下载不同毒株的aFP具体如下登P录RV号ＧF基因序列,::、ChiＧ登u录Y号an:g株(

(MF４４３３５２)、CMhiFn４a４３３H３e５)NC株hi(naG登录D株号:M(aTF４登i４录b３e３t４７)、株(C登hin登录号:)、录a号SC株(:号:KM０９１９５９E)U、３６M４o８n０g

９)M、oliaCFh４株i４n３a３３(登X８JY录LChi株Ｇ

号:(aXY８８登J８录B１Z６８)、株(ChinaZ号J株(登录号::号:KT６３３９３９．１)MFC４h４in３aT３３５)、登录、ibeCthi株Ｇia(登９７录４６号．１EU:K３、u６r４di８s０t９an．１)Mor、KocFc６o(登录号:C６０)、(登录号:４８２８７．１)、InＧ

录号J８６７:J５N４２６３．１、K２５３I４nFd７．１i５a２(４登录号４４．１):)、Nig

eria(GN登录号Qet４h１e０r４lands(

登录号:)、(登:３H５Q．１)１９７I７n５di３a．１)、对基酸序列分析PPRVＧF基因编码的蛋白进行分析,其中包括氨:berg．de/),ExPSAMASYR(hT(ttpht:t:///p

/websm．eaxrpta．seym．bolrＧgh/epidroeltＧＧspearrvaim/);信号肽预测:(:///ces/SignalP/);跨膜区预测http

:w(hwttw．p:c/b/sw．dwtw．u．cdbks．tdt结构预测pu:/．d/k/imseedrv:J．ipmcrees/edd３．uT(cMHMMhm．ttpes/://TＧ/);抗原性预测:(wo２owl．０s/w．acnotmigp

ebniioc．d．pul);二ht级Ｇ

undee．ac．２wk/　ww．ww结果

sbwgＧj．bpiroed);三级结构预测:i．c．ac．uk/phy

re２).Phyre２(http

://２．１　样品提取本中心获得的疑似PPRVＧF基因的RTＧPC经一步法基因,经１０g/L琼脂糖R凝TＧPPRVR扩增

阳性样品获得胶PC电R扩增,泳分析,

片段PPRNA,以此为模板,大R小VＧ约F为的病料为１６００bp,与预期的结果相符,初步证明本次获得PPRV阳性样品(

图１).M．M．DDNNA标准AMrkDeL２０rDL２０００;１０~０２;．样品１Ｇ２．RRTTＧＧPPCCRaR扩增产物PPRVsam图p

alesmp

lificationproductsof２．２F　Pig．１P　T１Rhe　样品resultsPofPPRPVRＧVF基因ＧFgeneRaTmＧpPliCficR扩增结果

ationbyR

TＧPCR进行测序CV.RＧF基因核苷酸序列分析

将P扩增为阳性的条带经胶回收纯化以后,所获得的序列,经测序大小为１６４１bp

,C１PRR４１１nKnndKK周海宁等:小反刍兽疫病毒F基因的序列分析

２１

将序列输入到N发现与CBI数据库中进行比对,)登录号:Kurdistan株(KF６４８２８７．１F基因核苷酸的PPRV阳性样品.

２．３　不同毒株PPRVＧF基因同源性分析

同源性为９进一步证实本实验室获得的病料为７％,将宁夏获得的PPRVＧF基因与GenBank下载的不同毒株的PPRVＧF基因进行核苷酸同源性分

ChinaXJYL(KM０９１９５９．１)等毒株同源性高达

与M同源性高达９９．６％,onolia株(KY８８８１６８．１)g与C同源性为９９．３％,hinaXJBZ株(KT６３３９３９．１)

/９８．１％;与我国所用疫苗株Nieria７５１株g()).同源性仅为９图２HQ１９７７５３．１２．８％(

、、naZJ(MF４４３３３５．１)ChinaSC(MF４４３３３８．１)ChiＧ

、和naHeN(MF４４３３４７．１)ChinaGD(MF４４３３５２．１)

析.结果显示,宁夏获得的PPRVＧF基因与ChiＧ

２．４　不同毒株PPRVＧF基因系统进化分析

从GenBank下载不同毒株的PPRVＧF基因序列,与本试验获得的PPRVＧF基因一起构建系统进化树.结果表明,宁夏获得的PPRVＧF基因与中国).同属谱系Ⅳ(图３７个毒株在同一个分支上,

其他省份分离的８个毒株及印度、蒙古等国报道的

Fi．２　NucleotidehomolonalsisofPPRVＧFgeneggyay

图２　PPRVＧF基因核苷酸同源性分析

:///在twww．combio．dundee．ac．ukwwwＧred)ppjp

线分析发现,PPRVF蛋白的二级结构中α螺旋F蛋白与其他麻疹病毒属成员融合蛋白结构相似().图７

并且在一些新的地PPR多流行于非洲和亚洲,

]７

,区不断有该病的报道[严重威胁养殖业,造成巨大

(占４占２无规则卷曲占H)３．２２％,E)０．５％,β折叠(

).P图６３６．２６％(hre２三级结构预测表明,PPRVＧy

２．５　PPRVＧF基因编码的氨基酸序列分析及F蛋

白结构预测

发现该基因编码PPRVＧF基因编码的氨基酸序列,,)分子质量为５理论等电点(５４６个氨基酸,９．２kuIp为８．不稳定系数是３小于阈值４属于稳定７１;６．６,０,蛋白,脂肪系数１总平均疏水指数０．０９．９８,２０１.　　利用SMART和ExPASY进行在线分析

３　讨论

的经济损失.该病于１９４２年首次在科特迪瓦暴发,目前已扩散到亚洲、非洲的４０余个国家.近年来,小反刍兽疫逐渐跨越地理屏障,扩散趋势不断上升,我国周边国家,如阿富汗、印度、尼泊尔等也都有

[]

我国地区发生第PPR流行的报道８.２００７年,

SinalP４．０在线预测分析表明,PPRVＧF蛋白有信g

.TMHMM号肽存在,为分泌型蛋白(图４)２．０预

.J测分析表明,图５)F蛋白有跨膜区(red３(htＧp

２２

动物医学进展　２总第３０１８年　第３９卷　第１１期(０５期)

Fi．３　PhloenetictreebasedonPPRVＧFgenegyg

图３　PPRVＧF基因的系统进化树

一起PPR疫情,２００８年－２０１０年在先后３次

[]Ｇ１０

.从２发生P国内２PR疫情９０１３年底开始,０多

个省份先后暴发了小反刍兽疫疫情,给养羊业带来

]１１Ｇ１３

.２巨大的经济损失[宁夏出现首例P０１４年,PR１４]

,疫情[在处２０１６年再发生一起输入型PPR疫情,

置该疫情的过程中,通过发病山羊的临床症状及剖检变化初步判定为P但仍需通过分子生物PR感染,学检测进行进一步验证.本中心将发病山羊的病料提取样品R经一步法PPR样品为试验材料,NA,

成功获得P大小为RTＧPCR扩增,PRVＧF基因,带回实验室,置－７０℃保存备用.本试验以该疑似

Fi．４　SinaletidepredictionresultsofPPRVＧFggpp

图４　PPRVＧF蛋白的信号肽预测结果

,编码５分子质量大约为５１６４１b４６个氨基酸,９．２p

Fi．５　PredictionoftransmembraneareaofPPRVＧFg

图５　PPRVＧF蛋白的跨膜区预测结果

周海宁等:小反刍兽疫病毒F基因的序列分析

２３

Fi．６　ThesecondartructureschematicofPPRVＧFgys

图６　PPRVＧF蛋白的二级结构示意图

了便于血清学监测,疫苗免疫后的同步检测是关键.因此,尽管现在的弱毒苗可以有效的预防该病,但是为了便于血清学的监测,标记疫苗更有发展前景.

可促使病PPRVＧF蛋白可帮助病毒进入宿主细胞,

毒囊膜和细胞膜融合.一旦病毒结合到宿主细胞的靶位,并允F蛋白就调节病毒膜和细胞膜的融合性,新合成的F蛋白可使细胞间发生融合,具有很好的手段去除了该基因的信号肽和跨膜区,构建了该基

Fi．７　ThetertiartructurediaramofPPRVＧFgysg

许释放的N蛋白进入细胞浆.在病毒感染过程中,

１９Ｇ２１]

.当前已经有学者通过基因工程候选疫苗潜力[

图７　PPRVＧF蛋白的三级结构示意图

因的原核表达质粒,并获得了表达,表达的蛋白具有

２２Ｇ２３]

,良好的免疫原性[但是并未对该蛋白做进一步

]１５

,.这与赵文姬报道的分离株特性相一致[ku

研究发现,对PPRVＧF基因核苷酸序列进行分

的研究,因此下一步拟研究蛋白的生物学功能,为研制基因工程疫苗奠定基础.参考文献:

[],１　KumarN,MaherchandaniSKashaetal．PestedespeＧypSK,

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析,不同地区来源毒株谱系不同.其中Ⅰ系主要来源塞内加尔和尼日利亚的毒株,Ⅱ系为几内亚和科特迪瓦的毒株,也门、苏Ⅲ系主要包括埃塞俄比亚、

[６]

.通过对F基因核苷丹毒株,Ⅳ系均为亚洲毒株１

酸序列进行分析,可以为该病毒在不同地理区域间

１７Ｇ１８]

.本试验获得的宁夏的传播情况提供线索[

[]２　BaronMD,DialloA,LancelotR,etal．PestedespetitsrumiＧ[]徐自忠,花群义,等．小反刍兽疫病毒分子生物学研究３　刘玉洪,[],,４　RussellCJKantorKL,Jardetzketal．AdualＧfunctionalyTS

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PPRVＧF基因与国内其他省份报道的F基因序列高

度同源,并且同属谱系Ⅳ,系统进化树分析显示,该蒙古等国７个毒株在同一个分支上,与之前的报道

１９Ｇ２１]

.相符[

基因与我国其他地区分离到的PPRV毒株及印度、

[]/王志亮,李　林,等．我国小反刍兽疫病毒C５　包静月,hina

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苗为弱毒苗,免疫效果有效.但是,弱毒苗无法鉴别免疫抗体和野毒感染抗体,这在一定程度上影响了疫病的诊断.在疫病的有效防控和非疫区申报过程中,疫病暴发后的血清学检测是一种重要的手段,为

当前应用在PPR防控计划中的小反刍兽疫疫

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CloninndSeuenceAnalsisofFGeneofPestedesPetitsRuminantsVirusgaqy

(１．Colleeoeterinaredicine,NorthwestA&FUniversitYanlinShaanxi,７１２１００,China;gfVyMy,gg,

１２２２１

,ZHOUHaiＧninYINCaiMALonWANGJinＧug,g,gy

,

dictedandanalzedbioinformaticsmethods．TheresultsshowedthatFgenewasamlifiedsuccessfullyybpy

,fromNinxiaPPRVpositivesamleandsimilarwith８strainsfromChinaand７strainsfromothercounＧgp

amlifiedbTＧPCR．ThepositivesamlewasanalzedbeuenceanalsisandphloenetictreewaspyRpyysqyyg

,constructed．MeanwhilethephsicalandchemicalproertiesandstructuresofPPRVＧFproteinwerepreＧyp

:,AbstractInordertoknowtheproertiesofFgeneofestedespetitsruminantsvirus(PPRV)asusectedppp

,PPRsamlewascollectedfromagoatfarminNinxia．TotalRNAwasextractedandPPRVＧFgenewaspg

２．NinxiaCenterorAnimalDiseaseControlandPrevention,Yinchuan,Ninxia,７５００１１,China)gfg,theisolateishomolooustoPPRVisolatesinotherprovincesofChina．Meanwhilebioinformaticsanalsisgyfunctionandgeneticenineerinaccine．ggv

:;;;KeordsPestedespetitsruminantsvirusFgenecloninseuenceanalsisgqyyw

,),tries(IndiaMonoliaetc．．Bioinformaticsanalsisshowedthattheproteinwasahdrohobicproteinhasgyyp

,asinaletideandtransmembranereion．AccordinotheanalsisofFgeneofNinxiaPPRVisolategppggtygoftheFproteinencodedbhePPRVＧFgenewilllaoundationforfurtherresearchonthebioloicalytyafg