利用GC-MS法快速分析大豆香气特征化合物2-乙酰基-1吡咯啉含量的方法

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109444314 A(43)申请公布日 2019.03.08

(21)申请号 201811433777.1(22)申请日 2018.11.28

(71)申请人 中国农业科学院作物科学研究所

地址 100000 北京市海淀区中关村南大街

12号中国农业科学院作物科学研究所(72)发明人 邱丽娟　张永芳　李富恒　孙如建　(74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569

代理人 刘奇(51)Int.Cl.

G01N 30/88(2006.01)

权利要求书1页 说明书7页 附图1页

CN 109444314 A(54)发明名称

利用GC-MS法快速分析大豆香气特征化合物2-乙酰基-1吡咯啉含量的方法及应用(57)摘要

本发明提供了利用GC-MS法快速分析大豆香气特征化合物2-乙酰基-1吡咯啉含量的方法，属于有机物检测领域。本发明以气相色谱-质谱技术快速测定大豆中香气特征化合物2-AP，具有检测方法简单、易操作、样品与试剂消耗量少和结果准确可靠的特点，尤其适合于通过测定2-AP含量进行大豆育种前的大批量品种筛选，对提高大豆选育时香味鉴评结果的准确性和可靠性，为大豆香味鉴评结果由“语言描述主观型”向“数值定量型”转变提供了技术基础，对深入挖掘大豆的香味资源具有重要的意义。并利用该方法在国外品种、国内地方和育成品种及遗传群体材料中进行了应用。

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权　利　要　求　书

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1.利用GC-MS法快速分析大豆香气特征化合物2-乙酰基-1吡咯啉含量的方法，包括以下步骤：

(1)将大豆豆粉或开花期叶片、乙醇和无水硫酸钠混合后进行超声萃取，将所得萃取液与NaCl混合后进行离心分离，将所得上清液用0.22μm滤膜过滤，得到待测溶液，对所述待测溶液进行GC-MS检测，得到GC-MS检测结果，所述GC-MS检测结果包括2-乙酰基-1-吡咯啉的出峰时间以及峰面积；

(2)根据所述步骤(1)得到的峰面积以及预定的标准曲线，得到待测溶液中2-乙酰基-1-吡咯啉的浓度；所述标准曲线以2-乙酰基-1-吡咯啉标准溶液的浓度为横坐标、以2-乙酰基-1-吡咯啉标准溶液进行GC-MS检测的峰面积为纵坐标；

所述步骤(1)和(2)中GC-MS检测条件地包括:色谱条件：色谱柱为安捷龙DB-WAX毛细管柱：30m×0.25mm×0.25μm，柱温升温程序为60℃保持2min，10℃/min升至100℃，然后以30℃/min升至230℃，保持5min；恒线速度41.2cm/s，进样口温度为250℃；载气为高纯氦气；不分流进样，进样量为1μL；

质谱条件:电子轰击离子源，离子源温度为200℃；离子化能量为70eV；接口温度为220℃；全扫描方式，扫描范围为m/z 35～500。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中大豆豆粉或开花期叶片、乙醇和无水硫酸钠的用量比为(0.4～0.8g)：(1.5～3mL)：(0.1～0.2g)。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中超声萃取的时间为20～30min。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中大豆豆粉或开花期叶片与NaCl的质量比为(0.4～0.8)：(0.1～0.2)。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中2-乙酰基-1-吡咯啉标准溶液的浓度为4～0.25ppm。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中大豆经管磨机磨成豆粉或大豆开花期叶片经过剪碎处理。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)和(2)中GC-MS检测的2-乙酰基-1-吡咯啉的出峰时间为7.016min。8.根据权利要求1或7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)和(2)中GC-MS检测时以特征碎片离子m/z 83为目标离子、m/z 69和m/z111为参考离子。

9.一种利用GC-MS法快速分析大豆香气特征化合物2-乙酰基-1吡咯啉含量的方法在大豆选育中的应用，其特征在于，使用权利要求1～8任意一项所述的检测方法对大豆进行检测，筛选得到2-乙酰基-1吡咯啉含量高的大豆进行育种。

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利用GC-MS法快速分析大豆香气特征化合物2-乙酰基-1吡咯

啉含量的方法及应用

技术领域

[0001]本发明涉及有机物检测技术领域及方法应用，尤其涉及一种利用GC-MS法快速分析大豆香气特征化合物2-乙酰基-1吡咯啉含量的方法及应用。

背景技术

[0002]大豆起源于我国，是重要的植物蛋白和油脂来源，具有很高的营养价值和药用价值，被人们誉为“21世纪的健康食品”。我国生产的大豆主要用于食用，长期以来只重视产量和一般品质，忽略了香味品质。然而香味是大豆重要的品质指标之一，它不仅可以提高人的食欲，也具有重要的商品价值，因此，研究大豆香味不仅对培育优质大豆、改善豆制品风味具有重要的理论意义，对提高人们的幸福感具有重要的现实意义。研究发现，大豆的香气均源于2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)，有爆米花味。但是由于大豆中2-AP的化学性质不稳定且含量极低，使得2AP定量检测的难度增加。[0003]目前，现有技术中检测大豆中2AP的方法有：以大豆鼓粒期种子(主茎上部第四节上叶片充分展开时)为材料，利用自动顶空气相色谱法(HS-GC)通过内标物质2,4-二甲基吡啶(DMP)测定大豆2AP浓度；利用同位素内标物法测定2AP浓度。这些方法操作繁琐，所用仪器昂贵，且每次分析都必须添加内标物或外标物，使用成本相对较高且操作复杂。且有关将测定2AP在育种中的应用较少。

发明内容

[0004]鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用GC-MS法快速分析大豆香气特征化合物2-乙酰基-1吡咯啉含量的方法及应用。本发明利用GC-MS法快速测定大豆中2-AP，具有检测方法简单、易操作、样品与试剂消耗量少和结果准确可靠的特点。[0005]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006]一种利用GC-MS法快速分析大豆香气特征化合物2-乙酰基-1吡咯啉含量的方法，包括以下步骤：[0007](1)将大豆豆粉或开花期叶片、乙醇和无水硫酸钠混合后进行超声萃取，将所得萃取液与NaCl混合后进行离心分离，将所得上清液用0.22μm滤膜过滤，得到待测溶液，对所述待测溶液进行GC-MS检测，得到GC-MS检测结果，所述GC-MS检测结果包括2-乙酰基-1-吡咯啉的出峰时间以及峰面积；[0008](2)根据所述步骤(1)得到的峰面积以及预定的标准曲线，得到待测溶液中2-乙酰基-1-吡咯啉的浓度；所述标准曲线以2-乙酰基-1-吡咯啉标准溶液的浓度为横坐标、以2-乙酰基-1-吡咯啉标准溶液进行GC-MS检测的峰面积为纵坐标；[0009]所述步骤(1)和(2)中GC-MS检测条件地包括:[0010]色谱条件：色谱柱为安捷龙DB-WAX毛细管柱：30m×0.25mm×0.25μm，柱温升温程序为60℃保持2min，10℃/min升至100℃，然后以30℃/min升至230℃，保持5min；恒线速度

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41.2cm/s，进样口温度为250℃；载气为高纯氦气；不分流进样，进样量为1μL；[0011]质谱条件:电子轰击离子源，离子源温度为200℃；离子化能量为70eV；接口温度为220℃；全扫描方式，扫描范围为m/z 35～500。[0012]优选地，所述步骤(1)中大豆豆粉或开花期叶片、乙醇和无水硫酸钠的用量范围为(0.4～0.8g)：(1.5～3mL)：(0.1～0.2g)。[0013]优选地，所述步骤(1)中超声萃取的时间为20～30min。[0014]优选地，所述步骤(1)中大豆豆粉或开花期叶片与NaCl的质量比为(0.4～0.8)：(0.1～0.2)。[0015]优选地，所述步骤(2)中2-乙酰基-1-吡咯啉标准溶液的浓度为4～0.25ppm。[0016]优选地，所述步骤(1)中大豆开花期叶片经过剪碎处理。[0017]优选地，所述步骤(1)和(2)中GC-MS检测的2-乙酰基-1-吡咯啉的出峰时间为7.016min。

[0018]优选地，所述步骤(1)和(2)中GC-MS检测时以特征碎片离子m/z 83为目标离子、m/z 69和m/z 111为参考离子。

[0019]本发明还提供了一种利用GC-MS法快速分析大豆香气特征化合物2-乙酰基-1吡咯啉含量的方法在大豆选育中的应用，使用上述技术方案所述的检测方法对大豆进行检测，筛选得到2-乙酰基-1吡咯啉含量高的大豆进行育种。

[0020]本发明提供了一种利用GC-MS法快速分析大豆香气特征化合物2-乙酰基-1吡咯啉含量的方法，本发明以气相色谱-质谱技术(GC-MS)快速测定大豆中香气特征化合物2-AP，具有检测方法简单、易操作、样品与试剂消耗量少和结果准确可靠的特点，尤其适合于通过测定2-AP含量进行大豆育种前的大批量品种筛选，对提高大豆选育时香味鉴评结果的准确性和可靠性，为大豆香味鉴评结果由“语言描述主观型”向“数值定量型”转变提供了技术基础，对深入挖掘大豆的香味资源具有重要的意义。实施例的数据表明，本发明提供的检测方法能够准确得到2-乙酰基-1吡咯啉的特征峰，且标准曲线的相关系数R2＝0.9998，对同一样品进行检测的相对标准偏差为1.5％，检测方法精密度高，其在国内外大豆高含量2AP育种中将有重要意义。

附图说明

[0021]下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。[0022]图1为1ppm标准品scan扫描总离子流色谱图；[0023]图2为Nist谱库2-AP的质谱图；[0024]图3为标准方程的曲线。

具体实施方式

[0025]本发明提供了一种利用GC-MS法快速分析大豆香气特征化合物2-乙酰基-1吡咯啉含量的方法，包括以下步骤：[0026](1)将大豆豆粉或开花期叶片、乙醇和无水硫酸钠混合后进行超声萃取，将所得萃取液与NaCl混合后进行离心分离，将所得上清液用0.22μm滤膜过滤，得到待测溶液，对所述待测溶液进行GC-MS检测，得到GC-MS检测结果，所述GC-MS检测结果包括2-乙酰基-1-吡咯

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啉的出峰时间以及峰面积；[0027](2)根据所述步骤(1)得到的峰面积以及预定的标准曲线，得到待测溶液中2-乙酰基-1-吡咯啉的浓度；所述标准曲线以2-乙酰基-1-吡咯啉标准溶液的浓度为横坐标、以2-乙酰基-1-吡咯啉标准溶液进行GC-MS检测的峰面积为纵坐标；[0028]所述步骤(1)和(2)中GC-MS检测条件地包括:[0029]色谱条件：色谱柱为安捷龙DB-WAX毛细管柱：30m×0.25mm×0.25μm，柱温升温程序为60℃保持2min，10℃/min升至100℃，然后以30℃/min升至230℃，保持5min；恒线速度41.2cm/s，进样口温度为250℃；载气为高纯氦气；不分流进样，进样量为1μL；[0030]质谱条件:电子轰击离子源，离子源温度为200℃；离子化能量为70eV；接口温度为220℃；全扫描方式，扫描范围为m/z 35～500。[0031]本发明将大豆豆粉或开花期叶片、乙醇和无水硫酸钠混合后进行超声萃取，将所得萃取液与NaCl混合后进行离心分离，将所得上清液用0.22μm滤膜过滤，得到待测溶液，对所述待测溶液进行GC-MS检测，得到GC-MS检测结果，所述GC-MS检测结果包括2-乙酰基-1-吡咯啉的出峰时间以及峰面积。[0032]在本发明中，所述大豆豆粉或开花期叶片、乙醇和无水硫酸钠的用量范围优选为(0.4～0.8g)：(1.5～3mL)：(0.1～0.2g)，更优选为0.8g:3mL:0.2g。[0033]在本发明中，所述大豆开花期豆粉或开花期叶片优选经过剪碎处理。在本发明中，所述剪碎处理优选用剪刀剪碎成直径为2cm大小的形状。[0034]在本发明中，所述大豆开花期叶片优选为顶部叶片，所述大豆豆粉优选为Tube-mill-100管磨机(德国IKA公司生产)磨粉。[0035]在本发明中，所述超声萃取的时间优选为20～30min。[0036]在本发明中，所述大豆豆粉或开花期叶片、乙醇和无水硫酸钠的混合优选为在漩涡混合器(型号：XH-C)中震荡进行。[0037]在本发明中，所述大豆豆粉或开花期叶片与NaCl的质量比优选为(0.4～0.8)：(0.1～0.2)，更优选为4:1。本发明中，NaCl的作用为增加有机物在溶剂中的溶解度，减少有机物在水相的浓度，从而提高2-乙酰基-1-吡咯啉萃取率。[0038]与NaCl混合后，本发明优选将混合产物在室温下静置2h后再进行离心分离。在本发明中，所述离心分离优选为在低温离心机4℃、12000rpm下离心10min。[0039]得到待测溶液后，本发明优选将所述待测溶液放置在气质小瓶中(32mm×11mm)，旋紧盖子密封待用。[0040]在本发明中，所述GC-MS检测条件包括:[0041]色谱条件：色谱柱为安捷龙DB-WAX毛细管柱：30m×0.25mm×0.25μm，柱温升温程序为60℃保持2min，10℃/min升至100℃，然后以30℃/min升至230℃，保持5min；恒线速度41.2cm/s，进样口温度为250℃；载气为高纯氦气；不分流进样，进样量为1μL；[0042]质谱条件:电子轰击离子源，离子源温度为200℃；离子化能量为70eV；接口温度为220℃；全扫描方式，扫描范围为m/z 35～500。[0043]在本发明中，所述GC-MS检测的2-乙酰基-1-吡咯啉的出峰时间优选为7.016min。在本发明中，2-乙酰基-1-吡咯啉的出峰时间通过与NIST库对比得到。[0044]在本发明中，所述GC-MS检测时优选以特征碎片离子m/z 83为目标离子、m/z 69和

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m/z 111为参考离子。

[0045]根据得到的峰面积以及预定的标准曲线，得到待测溶液中2-乙酰基-1-吡咯啉的浓度；所述标准曲线以2-乙酰基-1-吡咯啉标准溶液的浓度为横坐标、以2-乙酰基-1-吡咯啉标准溶液进行GC-MS检测的峰面积为纵坐标。[0046]在本发明中，所述2-乙酰基-1-吡咯啉标准溶液的浓度优选为4～0.25ppm，更优选为4ppm、2ppm、1ppm、0.5ppm或0.25ppm。[0047]在本发明中，所述2-乙酰基-1-吡咯啉标准溶液优选由以下方法制备得到：将2-AP标准品10mg溶解于100mL无水乙醇中，配置成1000ppm的标准储备液，置于4℃冰箱中保存备用；利用逐级稀释的方法将标准储备液分别配制成4ppm、2ppm、1ppm、0.5ppm、0.25ppm的标准溶液，用一次性注射器吸取1mL，并用0.22μm滤膜过滤于气质小瓶中(32mm×11mm)编号，置于样品瓶中并编号，旋紧盖子密封待用。[0048]在本发明中，所述GC-MS检测的步骤与上述方案一致，在此不再赘述。[0049]在本发明中，所述标准曲线为y＝115373x+1483.1，相关系数R2＝0.9998。

[0050]本发明还提供了一种利用GC-MS法快速分析大豆香气特征化合物2-乙酰基-1吡咯啉含量的方法在大豆选育中的应用，使用上述技术方案所述的检测方法对大豆进行检测，筛选得到2-乙酰基-1吡咯啉含量高的大豆进行育种。

[0051]下面结合实施例对本发明提供的大豆中2-乙酰基-1吡咯啉的检测方法及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。[0052]实施例1

[0053]1.标准储备液的配制：将2-AP标准品10mg溶解于100mL无水乙醇中，配置成1000ppm的储备液，置于4℃冰箱中保存备用。[0054]2.标准溶液的配制：利用逐级稀释的方法将标准储备液分别配制成4ppm、2ppm、1ppm、0.5ppm、0.25ppm的标准溶液，用一次性注射器吸取1mL，并用0.22μm滤膜过滤于气质小瓶中(32mm×11mm)编号，置于样品瓶中并编号，旋紧盖子密封待用。[0055]3.样品的制备：取大豆豆粉或开花期顶部叶片2片，准确称取0.8g，用剪刀剪碎成直径为2cm大小的形状，置于盛有3mL酒精及0.2g无水硫酸钠的10mL离心管中，用漩涡混合器(型号：XH-C)震荡混匀数分钟后超声萃取20min，加入0.2gNaCl，静置2h后于低温离心机4℃12000rpm离心10min，用一次性注射器取1mL上清并用0.22μm滤膜过滤于气质小瓶中(32mm×11mm)编号，旋紧盖子密封待用。[0056]4.GC-MS 2010色谱质谱条件:[0057]色谱条件：色谱柱为安捷龙DB-WAX毛细管柱：30m×0.25mm×0.25μm，柱温升温程序为60℃保持2min，10℃/min升至100℃，然后以30℃/min升至230℃，保持5min；恒线速度41.2cm/s，进样口温度为250℃；载气为高纯氦气(纯度＞99.999％)；不分流进样，进样量为1μL；[0058]质谱条件:电子轰击离子源(EI)，离子源温度为200℃；离子化能量为70eV；接口温度为220℃；全扫描方式，扫描范围为m/z 35～500。[0059]5.定性分析和定量分析方法:[0060]5.1 2-AP的定性分析采用NIST库检索。[0061]5.2 2-AP出峰时间的确定及标准曲线的绘制：以1ppm为例，按照上述第4部分GC-6

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MS条件进行SCAN扫描，获得GC-MS总离子流色谱图(见图1)，对所得的峰积分并通过NIST谱库检索2-AP标准质谱图(见图2)，确定2-AP(峰1)的出峰时间为7.016min，与谱库2-AP相似度为91％，同样按照第4部分GC-MS条件建立sim方法，设置特征碎片离子m/z 83为目标离子、m/z 69和m/z 111为参考离子，以7.016为标准分析标准品，将标准溶液按照浓度从低到高排列，放于样品盘中，每一浓度进样3针，按其所得峰面积的平均值为纵坐标，对应的标液浓度为横坐标拟合标准曲线，计算出回归方程为y＝115373x+1483.1和相关系数R2＝0.9998(见图3)，获得不同浓度梯度2-AP碎片离子流图。[0062]5.2方法的精密度：[0063]5.2.1仪器的精密度：

[00]取浓度为1.0ppm标准溶液按选定的色谱条件重复进样6次，得到2AP的峰面积，计算其相对标准偏差RSD分别为0.8％，说明仪器重复性满足要求。[0065]5.2.2方法的精密度

[0066]选取含有2AP的大豆待测样品，进行4次平行测定，实验结果见表1，相对标准偏差1.5％，表明方法精密度高。

[0067]表1方法精密度实验结果

[0068]

6.2AP在我国育成及地方品种选育中的应用

[0070]应用以上测定大豆2AP的方法对我国育成、地方品种共240份进行筛选其中10份材料含有较高浓度的2AP，分别为：具体材料、2AP含量及地理分布见表2，由表2可知，大豆2AP的含量较低，数量级为百万分之一，不同品种所含的2AP含量不同，变异范围为0.003ppm-0.215ppm，其中宁陵天鹅蛋较高，2AP含量为0.215ppm，其次为通化平顶香，2AP含量为0.203ppm。[0071]表2 10份国内材料的2AP含量

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[0072]

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7.2AP在国外品种选育中的应用

[0075]应用以上测定大豆2AP的方法对国外品种共50份进行筛选，其中，10份材料含有较高浓度的2AP，具体材料、2AP含量及地理分布见表3，由表3可知，不同国家的大豆品种所含的2AP含量也不同，变异范围为0.003ppm-0.331ppm，其中日本的saikai20较高，2AP含量为0.331ppm，其次为美国的Essex，2AP含量为0.152ppm。[0076]表3 10份国外材料的2AP含量

[0074]

[0077]

[0078]

8.2AP在大豆遗传群体中的应用[0080]利用本方法同时鉴定了中黄35(2AP含量为0)及十胜长叶(2AP含量为0.0814)的遗传群体的株系328份材料，发现在后代群体中不同株系存在差异，其2AP含量分布范围为0-0.09ppm。这些研究结果为香味基因的定位奠定了理论基础。[0081]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人

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员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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图3

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