第３４卷第６期 新乡医学院学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖｏ１．３４ Ｎｏ．６ ２０１７年６月 Ｊｕｎ．２０１７ ・４８９・ ●ｏ０●００◆ｏ０◆ｏ０◆０ｏ●００●ｏ０◆ｏｏ●ｏ０◆００◆ｏｏ●ｏｏ●ｏ０●ｏｏ●ｏ０◆ｏｏ●００◆０ｏ●ｏｏ◆００●ｏｏ●ｏｏ◆００●ｏｏ●００◆００◆００◆ｏｏ●ｏ０◆０ｏ◆００◆ｏｏ◆００ 本文 王慧睿，郭淑利，李波，等．伊马替尼治疗后慢性粒细胞白血病患者ＢＣＲ－ＡＢＬ酪氨酸激酶区突变特征 分析［Ｊ］．新乡医学院学报，２０１７，３４（６）：４８９－４９２．ＤＯＩ：１０．７６８３／ｘｘｙｘｙｘｂ．２０１７．０６．００９． ◆ｏｏ◆０ｏ◆０ｏ●００●００●ｏ０●ｏｏ◆００◆００●００●００●００◆００◆００●００◆０Ｏ◆Ｏ０●００◆０Ｏ●００◆００●００●００●Ｏｏ●００●００◆０Ｏ◆００●ＯＯ◆０Ｏ◆００●００●００ 【临床研究】 伊马替尼治疗后慢性粒细胞白血病患者ＢＣＲ－ＡＢＬ酪氨酸激酶区 突变特征分析 王慧睿，郭淑利，李 波，王万里，王松云，肖蓬莉，田红旗 （郑州大学附属洛阳中心医院血液内科，河南摘要： 目的方法洛阳４７１００９） 研究伊马替尼治疗的慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）患者ＢＣＲ—ＡＢＬ酪氨酸激酶区点突变发生情况。 对伊马替尼治疗的３０例ＣＭＬ患者的３７份骨髓标本采用巢式反转录一聚合酶链式反应进行反转录、扩增、测 序；应用ＧｅｎｅＢａｎｋ进行序列同源性比较，分析ＢＣＲ—ＡＢＬ酪氨酸激酶区点突变发生情况，并分析其与伊马替尼耐药的 关系。结果３０例患者检出突变ｌ０例，阳性率３３．３％。１０例突变患者共检出９种点突变，分别为Ｔ３１５Ｉ ２例、Ｅ２５５Ｋ １例、Ｄ２７６Ｇ＋Ｆ３１７Ｌ １例、Ｆ３１７Ｌ ２例、Ｙ２５３Ｈ＋Ｍ２４４Ｖ １例、Ｆ３５９Ｖ １例、Ｈ３９６Ｒ １例、Ｅ２７９Ｋ １例。ＣＭＬ＿方日速／急变期 （ＡＰ／ＢＰ）、ＣＭＬ一慢性期（ＣＰ）患者的突变检出率分别为３８．５％（５／１３）和２９．４％（５／１７），ＣＭＬ—ＡＰ／ＢＰ患者突变检出率 与ＣＭＬ—ＣＰ患者比较差异无统计学意义（ ＝１．２５８，Ｐ＞０．０５）；１０例点突变患者中７例检出点突变时疾病进展至ＡＰ／ ＢＰ，３例患者检出点突变时仍处于ＣＰ；ＡＰ／ＢＰ患者检出点突变的中位时间为６个月，明显早于ｃＰ患者的２Ｏ个月 （ ：９．１０３，Ｐ＜０．０５）。结论ＢＣＲ—ＡＢＬ酪氨酸激酶区点突变是伊马替尼治疗ＣＭＬ失败的主要原因之一，定期监测 ＢＣＲ—ＡＢＬ酪氨酸激酶区突变有助于酪氨酸激酶抑制剂疗效的评估和治疗方案的调整。 关键词： 伊马替尼；慢性粒细胞白血病；酪氨酸激酶区；点突变 中图分类号：Ｒ７３３．７２文献标志码：Ａ文章编号：１００４—７２３９（２０１７）０６—０４８９—０４ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＢＣＲ．．ＡＢＬ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｍａｔｉｎｉｂ ｔｒｅａｔｅｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙ．． ｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ＷＡＮＧ Ｈｕｉ—Ｉ１Ｊｉ，ＧＵＯ Ｓｈｕ—ｌｉ，ＬＩ Ｂｏ，ＷＡＮＧ Ｗａｎ—ｌｉ，ＷＡＮＧ Ｓｏｎｇ—ｙｕｎ，ＸＩＡＯ Ｐｅｎｇ—ｌｉ，ＴＩＡＮ Ｈｏｎｇ—ｑｉ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｌｕｏｙａｎｇ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ ｔｏ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｕｏｙａｎｇ ４７１００９，Ｈｅｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ＢＣＲ—ＡＢＬ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｍａｔｉｎｉｂ ｔｒｅａｔｅｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙ— ｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＣＭＬ）ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｏｔａｌｌｙ ３７ ｂｏｎｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ３０ ＣＭＬ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ．Ａｌｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｒｅｖｅｒｓｅｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ，ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｎｅｓｔｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ—ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ— ＰＣＲ）；ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗａｓ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂｙ ＧｅｎｅＢａｎｋ．Ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ＢＣＲ—ＡＢＬ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｐｏｉｎｔ ｍｕ— ｔａｔｉｏｎｓ ｗａｓ ａｎａｌｙｓｅｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ｉｍａｔｉｎｉｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｎ ｔｈｅ ３０ ｐａｔｉｅｎｔｓ，ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＢＣＲ— ＡＢＬ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ １０ ｐａｔｉｅｎｔｓ（３３．３％）．Ｎｉｎｅ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｔ３１５Ｉ ｉｎ ｔｗｏ ｐａ— ｔｉｅｎｔｓ，Ｅ２５５Ｋ ｉｎ ｏｎｅ ｐａｔｉｅｎｔ，Ｄ２７６Ｇ ａｎｄ Ｆ３１７Ｌ ｉｎ ｏｎｅ ｐａｔｉｅｎｔ，Ｆ３１７Ｌ ｉｎ ｔｗｏ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｙ２５３Ｈ ａｎｄ Ｍ２４４Ｖ ｉｎ ｏｎｅ ｐａｔｉｅｎｔ， Ｆ３５９Ｖ ｉｎ ｏｎｅ ｐａｔｉｅｎｔ，Ｈ３９６Ｒ ｉｎ ｏｎｅ ｐａｔｉｅｎｔ，Ｅ２７９Ｋ ｉｎ ｏｎｅ ｐａｔｉｅｎｔ．Ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＭＬ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔａｇｅ ｏｆ ａｃ－ ｃｅｌｅｒａｔｅｄ—ｐｈａｓｅ／ｂｌａｓｔ—ｐｈａｓｅ（ＡＰ／ＢＰ）ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ—ｐｈａｓｅ（ｃＰ）ｗａｓ ３８．５％（５／１３）ａｎｄ ２９．４％（５／１７）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｐｈａｓｅ（ ＝１．２５８，Ｐ＞０．０５）．Ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ， ｓｅｖｅｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｄ ｔｏ ＡＰ／ＢＰ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ，ａｎｏｔｈｅｒ ｔｈｒｅｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｔｉｌｌ ａｔ ＣＰ．Ｔｈｅ ｍｅｄｉａｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ６ ｍｏｎｔｈｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｔ ｔｈｅ ｓｔａｇｅ ｏｆ ＡＰ／ＢＰ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｃａｎｔｆｌｙ ｅａｒｌｉｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｔ ｔｈｅ ｓｔａｇｅ ｏｆ ＣＰ（２０ ｍｏｎｔｈｓ）（Ｘｚ＝９．１０３，Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＢＣＲ—ＡＢＬ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｒｅａｓｏｎｓ ｏｆ ｉｍａｔｉｎｉｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｒｅｇｕｌａｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ＢＣＲ—ＡＢＬ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｓ ｈｅｌｐｆｕｌ ｉｎ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｉｃａｃｙ ｆｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（ＴＫＩ）ｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＣＭＬ ａｎｄ ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｇｉｍｅｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｉｍａｔｉｎｉｂ；ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ；ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｐｈ染色体阳性（Ｐｈ ）慢性粒细胞白血病（ｃｈｒｏｎ— ＤＯＩ：１０．７６８３／ｘｘｙｘｙｘｂ．２０１７．０６．００９ 收稿日期：２０１７—０３—１２ ｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ，ＣＭＬ）发病的分子基础是ｔ （９；２２）易位形成具有酪氨酸激酶活性的ＢＣＲ．ＡＢＬ融 合蛋白 。以甲磺酸伊马替尼（简称伊马替尼）为 作者简介：王慧睿（１９７８一），女，河南洛阳人，博士，副教授，主要从 事血液病的诊断治疗工作。 代表的酪氨酸激酶抑制剂（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ， ・４９０・ 新乡医学院学报 ＴＫＩ）的出现为Ｐｈ ＣＭＬ患者的治疗带来了性变 化，但仍有部分患者对伊马替尼耐药 Ｊ。其耐药机制 包括ＢＣＲ—ＡＢＬ基因扩增、ＢＣＲ—ＡＢＬ激酶区点突变以 及其他癌基因活化等，其中ＢＣＲ—ＡＢＬ激酶区点突变 是ＣＭＬ患者发生伊马替尼耐药的主要原因，５０％以 上耐药患者存在ＢＣＲ．ＡＢＬ激酶区点突变 。本研 究选取伊马替尼临床治疗效果欠佳（如血液学复发、 细胞遗传学复发、出现附加染色体以及丧失分子生物 学反应）的ＣＭＬ患者为研究对象，应用巢式反转录 聚合酶链式反应（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ—ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＲＴ—ＰＣＲ）扩增ＢＣＲ—ＡＢＬ激酶区并测序 以确定ＢＣＲ．ＡＢＬ激酶区点突变在伊马替尼治疗患者 中的发生情况并分析其临床意义。 １资料与方法 １．１一般资料选取２０１３年６月至２０１６年１Ｏ月 在郑州大学附属洛阳中心医院血液科门诊和住院服 用伊马替尼（江苏豪森药业股份有限公司，国药准 字Ｈ２０１３３２００）治疗的３０例ＣＭＬ患者共３７份骨髓 标本为研究对象。伊马替尼治疗开始时该３０例患 者中１３例处于加速／急变期（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ—ｐｈａｓｅ／ ｂｌａｓｔ—ｐｈａｓｅ，ＡＰ／ＢＰ），１７例处于慢性期（ｃｈｒｏｎｉｃ— ｐｈａｓｅ，ＣＰ）（其中３例为慢性后期）。伊马替尼临床 治疗效果欠佳时重新评估患者的疾病分期，并行 ＢＣＲ．ＡＢＬ激酶区点突变的检测。临床诊断均参照 《血液病诊断及疗效标准》［６ ３。ＣＰ指外周血或骨髓 中原始细胞＜１０％；未达到诊断ＡＰ／ＢＰ的标准。慢 性后期指伊马替尼治疗前病史＞１２个月，未行ＴＫＩ 治疗，但仍处于ＣＰ。无变化指疾病未发生进展仍处 于ＣＰ。ＡＰ指符合下列任何１项：外周血或骨髓中 原始细胞在１０％～１９％；外周血中嗜碱细胞≥ ２０％；与治疗无关的持续血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ，ＰＬＴ）减少 （ＰＬＴ＜１００×１０ Ｌ ）或治疗无效的持续增高 （ＰＬＴ＞１ ０００×１０ Ｌ ）；细胞遗传学有克隆演变； 治疗无效的持续白细胞（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ，ＷＢＣ）计 数增加（ＷＢＣ＞１０ ｘ １０ Ｌ ）和脾脏持续或进行性 增大且治疗无效。ＢＰ指外周血或骨髓有核细胞中 原始细胞Ｉ＞２０％；骨髓活检提示原始细胞聚集；髓外 原始细胞浸润。转入ＡＰ／ＢＰ指血液学失效发生疾 病进展由ＣＰ转入ＡＰ／ＢＰ。３０例患者中男２０例，女 １０例，年龄２２～７９岁，中位年龄４６岁。伊马替尼 治疗中位随访时间１９个月（０．５～６６．０个月）。伊 马替尼用药原则为：ＡＰ／ＢＰ患者６００ ｍｇ・ｄ 或 ８００ ｍｇ・ｄ～，ＣＰ患者４００ ｍｇ・ｄ～，根据患者病情 及血常规检查结果再调整药量。 １．２ ｃＤＮＡ制备根据白细胞计数采集相应的标 本量，以保证足量的有核细胞数，使用乙二胺四乙酸 二钠抗凝标本。采用裂解红细胞的方法获得有核细 ２０１７年第３４卷 胞，使用ＴＲＩｚｏｌ试剂（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）提取总 ＲＮＡ。使用反转录试剂盒（日本ＴａＫａＲａ公司）进行 ＲＮＡ的反转录获得ｃＤＮＡ样本。 １．３ ＢＣＲ－ＡＢＬ激酶区扩增采用巢式ＲＴ—ＰＣＲ扩 增ＢＣＲ—ＡＢＬ激酶区。第１轮扩增所用引物：Ｐ２１０ 型ＢＣＲ—ＡＢＬ：ＳＭＢＦｌ／ＳＭＡＲ（ＳＭＢＦ１ ５ 一ＴＧＡＣ— ＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＣＴＣ一３ ．ＳＭＡＲ ５ －ＴＣＣＡＣＴ— ＴＣＧＴＣＴＧＡＧＡＴＡＣＴＧＧＡＴＴ．３ ）；Ｐ１９０型ＢＣＲ－ＡＢＬ： ＳＭＢＦ２／ＳＭＡＲ ｆ ＳＭＢＦ２ ５ 一ＡＣＣＧＣＡＴＧＴＴＣＣＧＧＧＡ－ ＣＡＡＡＡＧ一３ ．ＳＭＡＲ ５ 一ＴＣＣＡＣＴＴＣＧＴＣＴＧＡＧＡＴＡＣＴ— ＧＧＡＴＴ一３ ）。反应条件为９５℃５ ｍｉｎ；９５ ｃＩ＝４０ ｓ， ６１℃１ ｍｉｎ，７２℃２ ｍｉｎ，３０个循环；７２℃７ ｍｉｎ。 ＰＣＲ产物大小：Ｐ２１Ｏ型（ｂ２ａ２／ｂ３ａ２）：１ ５０４／ １ ５７９ ｂｐ；Ｐ１９０型（ｅｌａ２）：１ ６４１ ｂｐ。第２轮扩增所 用引物均为ＳＭＡＦ／ＳＭＡＲ（ＳＭＡＦ ５ ．ＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣ— ＣＣＡＣＴＧＴＣＴ＿３ ．ＳＭＡＲ ５ －ＴＣＣＡＣＴＴＣＧＴＣＴＧＡＧＡＴ— ＡＣＴＧＧＡＴＦ．３ ），反应条件为９５ ｃｌＣ ５ ｍｉｎ；９５℃ ４０ Ｓ，６２℃１ ｍｉｎ，７２ ｏＣ １．５ ｍｉｎ，３０个循环；７２ ｏＣ ７ ｒａｉｎ，ＰＣＲ产物为８６３ ｂｐ，相应于ＢＣＲ—ＡＢＬ蛋白的 第２２０～５０６个氨基酸。 １．４测序及结果分析ＰＣＲ产物采用切胶纯化法 去除非特异条带，采用上下游引物分别进行双向测 序。测序结果应用ＧｅｎｅＢａｎｋ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ． ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）进行序列同源性比较，确定 突变点，判断相应氨基酸。 １．５统计学处理应用ＳＰＳＳ １６．０软件进行统计 学分析，ＡＰ／ＢＰ和ＣＰ患者中ＢＣＲ—ＡＢＬ激酶区点突 变比例比较采用非参数 检验；ＡＰ／ＢＰ和ｃＰ患者 ＢＣＲ—ＡＢＬ激酶区点突变发生时问比较采用Ｋａｐｌａｎ— Ｍｅｉｅｒ法分析；Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 ２ 结果 ２．１ ＢＣＲ．ＡＢＬ激酶区点突变检出率３０例患者 点突变率为３３．３％（１０／３０）。伊马替尼治疗时为 ＡＰ／ＢＰ及ＣＰ患者的突变检出率分别为３８．５％（５／ １３）及２９．４％（５／１７），２组患者突变检出率比较差 异无统计学意义（ ＝１．２５８，Ｐ＞０．０５）。伊马替尼 治疗时为ＣＰ后期的３例患者的突变检出率为 ６７．７％（２／３）。１０例点突变患者中７例患者检出点 突变时处于ＡＰ／ＢＰ，３例患者检出点突变时仍处于 ＣＰ。该３例患者中，１例患者为伊马替尼持续治疗 ２７个月，持续主要分子生物学反应（ｍａｊｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＭＭＲ）１６个月，７个月前被检出ＢＣＲ—ＡＢＬ 转录本水平升高（ＢＣＲ—ＡＢＩ／ＡＢＬ：０．５３１％）、Ｆ３１７Ｌ 点突变，给予该患者二代ＴＫＩ治疗，随访７个月患者 病情稳定；１例为ＣＰ后期患者，伊马替尼治疗２７个 月，持续遗传学完全缓解（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅ— ｓｐｏｎｓｅ。ＣＣｙＲ）２１个月，１２个月前检出染色体核型： 第６期 王慧睿，等：伊马替尼治疗后慢性粒细胞白血病患者ＢＣＲ．ＡＢＬ酪氨酸激酶区突变特征分析 。４９１・ ４６，ＸＸ，ＢＣＲ．ＡＢＬ转录本水平为ＢＣＲ－ＡＢＬ／ＡＢＬ： ２３．７２％、Ｈ３９６Ｒ突变，予二代ＴＫＩ治疗，随访１２个 出Ｉ３１５Ｉ突变的２例患者，１例在伊马替尼治疗前 已进展至ＡＰ／ＢＰ，伊马替尼治疗无效，疾病进展迅 速，患者死亡；１例为ＣＰ患者，经伊马替尼间断治疗 ２０个月后检出Ｔ３１５Ｉ突变，拒绝造血干细胞移植换 月患者病情稳定；１例患者间断服用伊马替尼治疗 １０个月后ＢＣＲ．ＡＢＬ转录本水平升高（ＢＣＲ—ＡＢｋ／ ＡＢＬ：３６．１５％），染色体核型：４６，ＸＸ，ｔ（９；２２）（ｑ３４； ｑｌ１），未检出点突变；间断服用伊马替尼治疗２０个 月后ＢＣＲ．ＡＢＬ转录本水平升高至ＢＣＲ—ＡＢＬ／ＡＢＬ： ８１．０６％，检出Ｔ３１５Ｉ突变，服用二代ＴＫＩ治疗，随访 ６个月患者病情稳定未进展至ＡＰ／ＢＰ。 ２．２ ＢＣＲ－ＡＢＬ激酶区点突变情况及不同疾病分 期患者点突变类型分布情况结果见表１和表２。 ５例ＡＰ／ＢＰ患者首次检出点突变的中位时间为６个 月（２～１５个月），５例ＣＰ患者首次检出点突变的中 位时间为２２个月（２０～２７个月）。ＡＰ／ＢＰ患者最早 检出点突变的时间（２个月）显著早于ＣＰ患者最早 检出点突变的时间（２０个月）。ＡＰ／ＢＰ患者首次检 用二代ＴＫＩ治疗，目前尚未进展至ＡＰ／ＢＰ。１例 Ｅ２５５Ｋ突变的患者在伊马替尼治疗前已进展至ＡＰ， 伊马替尼治疗６个月未获得血液学缓解，被检出 Ｅ２５５Ｋ突变，换用二代ＴＫＩ治疗２个月后未获得血 液学缓解，病情进展迅速，患者死亡。本研究中 Ｆ３１７Ｌ的突变检出率最高，共检出３次，２例处于 ＢＰ，１例处于ＣＰ，换用二代ＴＫＩ治疗后，均表现为有 效。Ｙ２５３Ｈ和Ｍ２４４Ｖ突变发生于同一患者，该患 者为ＣＰ后期，服用伊马替尼治疗２０个月后进展至 ＢＰ，伴Ｐｈ阳性克隆性异常（＋８，＋１７），换用二代 ＴＫＩ治疗效果差，患者死亡。Ｆ３５９Ｖ突变患者伊马 替尼治疗时已进展至ＡＰ，伊马替尼治疗１２个月未 出点突变的中位时间早于ＣＰ患者，差异有统计学 意义（ ＝９．１０３，Ｐ＜０．０５）。１０例检出ＢＣＲ－ＡＢＬ 蛋白激酶点突变的患者中，共检出９种点突变共１２ 次。具有１３１５Ｉ、Ｅ２５５Ｋ、Ｆ３１７Ｌ、Ｙ２５３Ｈ、Ｆ３５９Ｖ突变 的患者，临床上均表现为典型的伊马替尼耐药。检 表１检出ＢＣＲ－ＡＢＬ激酶区点突变患者的基本情况 达到血液学缓解和任何细胞遗传学反应，检出 Ｆ３５９Ｖ突变后换用二代ＴＫＩ治疗有效，目前患者处 于ＣＰ病情稳定。仅有１例患者突变在Ａ环 （Ｈ３９６Ｒ），未发生疾病进展，换用二代ＴＫＩ治疗 有效。 Ｔａｂ．１ Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉＵｌ ＢＣＲ－ＡＢＬ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ 疾病分期 ＡＰ／ＢＰ ｎ— 夏 ——— 妻 —— — —＿ —— —— 碧 ——— 转入ＡＰ／ＢＰ期 ＣＰ后期 无变化（ＣＰ） ３讨论 伊马替尼靶向作用于ＢＣＲ．ＡＢＬ，从根本上改变 了ＣＭＬ的治疗流程和结果，但是耐药性的产生给伊 马替尼的治疗带来了困难 。目前认为，ＢＣＲ． ＡＢＬ酪氨酸激酶区突变是ＣＭＬ患者对伊马替尼耐 患者激酶区突变率为３４．２％，本研究的突变检出率 与朱平等 的报道相似。ＱＩＮ等 对１２７例伊马替 尼耐药ＣＭＬ患者ＢＣＲ—ＡＢＬ激酶区点突变进行检 测，突变检出率为５８％；ＫＩＭ等 对１３７例韩国伊 马替尼耐药ＣＭＬ患者ＢＣＲ—ＡＢＬ激酶区点突变进行 检测，突变检出率为６３％；ＧＩＭＥＭＡ工作组对Ｐｈ ＣＭＬ／急性淋巴细胞白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅ． ｍｉａ，ＡＬＬ）患者突变检出率为４３％ｌ１０］；本研究检测 到的突变率低于以上几个研究，可能与本研究标本 量较少，追踪随访时间短有关。 药的主要原因，其发生机制目前尚未阐明。作者使 用ＡＢＬ基因直接测序法对３０例伊马替尼治疗时处 于ＡＰ／ＢＰ及ＣＰ、伊马替尼临床治疗效果欠佳、在治 疗不同时间的３７份标本进行检测，突变率为 ３３．３％（１０／３０）。朱平等 报道伊马替尼耐药ＣＭＬ 多项研究表明，处于疾病进展期的伊马替尼耐 ・４９２・ 新乡医学院学报 药ＣＭＬ患者的突变发生率较高。ＫＩＭ等 研究发 现，ＣＰ、ＡＰ和ＢＰ ＣＭＬ患者的突变发生率依次为 ３６％、６７％和８３％；ＳＯＶＥＲＩＮＩ等¨ 研究表明，ＣＰ． ＣＭＬ患者的突变发生率为２７％，而ＢＰ／Ｐｈ ＡＬＬ患 者的突变发生率为７９％。本研究中ＡＰ／ＢＰ－ＣＭＬ患 者的突变率（３８．５％）略高于ＣＰ—ＣＭＬ患者的突变 率（２９．４％），但二者比较差异无统计学意义。本研 究结果与ＱＩＮ等 的结果相似，可能由于都使用直 接测序法检测点突变位，而ＫＩＭ等 和ＳＯＶＥＲＩＮＩ 等＿１ 使用了更敏感的高效液相色谱联合测序法检 测点突变有关。除此之外，患者种族的差异也可能 是导致研究结果不一致的原因。 目前发现的ＢＣＲ—ＡＢＬ激酶区点突变大致可分 为４种类型：Ｐ环突变、伊马替尼结合位点突变 （Ｔ３１５／Ｆ３１７）、催化结构域内突变和活化环（Ａ— ｌｏｏｐ）突变¨ 。本研究检出的突变以Ｆ３１７Ｌ发生率 最高，其次为Ｔ３１５Ｉ、Ｅ２５５Ｋ、Ｙ２５３Ｈ、Ｍ２４４Ｖ、 Ｈ３９６Ｒ、Ｄ２７６Ｇ、Ｆ３５９Ｖ、Ｅ２７９Ｋ，主要位于伊马替尼 结合位点以及Ｐ环。多项研究表明，ＣＭＬ突变以 Ｔ３１５Ｉ及位于Ｐ环多见 。值得注意的是，本次研 究中Ｆ３１７Ｌ检出率最高，Ｔ３１５１次之，可能是由于标 本数量有限所致，需要进一步研究。多项研究表明， Ｐ环突变和Ｔ３１５１突变患者具有更差的无进展生存 和总生存 。 。本研究检测到的发生Ｐ环突变的２ 例患者，疾病进展迅速，较快死亡，与文献报道相 似¨ 。２例具有Ｔ３１５Ｉ突变的患者，１例为ＢＰ患 者，伊马替尼治疗无效死亡；１例为ＣＰ患者，不规律 服用伊马替尼２０个月后检出Ｔ３１５Ｉ突变，未行造血 干细胞移植换用二代ＴＫＩ治疗，目前随访６个月尚 未进展至ＡＰ／ＢＰ。Ｆ３１７Ｌ、Ｈ３９６Ｒ、Ｆ３９５Ｖ突变为伊 马替尼中度耐药，作者对发生该突变的患者换用二 代ＴＫＩ有效。报道Ｅ２７９Ｋ、Ｄ２７６Ｇ对伊马替尼耐药 的研究较少 １３－１４１，但是Ｅ２７９Ｋ突变为患者从ｃＰ进 展至ＢＰ时检出，换用二代ＴＫＩ治疗６个月后患者 ＢＣＲ—ＡＢＬ转录本水平为ＢＣＲ—ＡＢＬ／ＡＢＬ：０．００１％， Ｅ２７９Ｋ突变检测不到；Ｄ２７６Ｇ和Ｆ３１７Ｌ突变共同发 生于ＢＰ患者，该患者伊马替尼治疗无效换用二代 ＴＫＩ，目前随访中。此外，在本研究中ｌ５例发生疾病 进展患者中有８例患者未检出点突变，ｌ６例未发生 疾病进展的患者中有３例检出点突变，提示ＢＣＲ— ＡＢＬ激酶区突变是伊马替尼耐药的主要原因，但是 ＣＭＬ对伊马替尼耐药还存在其他因素。 本研究中１／３患者可检出ＢＣＲ—ＡＢＬ激酶区突 变，突变位点广泛，性质多样，部分为多位点突变同 时存在。不同患者第１次检出点突变与最终疾病进 展之间的间隔时问有较大差异，部分患者点突变检 出早于临床进展。因此，临床上除了定期对患者进 行必须的血液学、细胞遗传学检查以及分子生物学 ２０１７年第３４卷 定量ＢＣＲ—ＡＢＬ转录本水平外，早期监测ＣＭＬ患者 尤其是处于ＡＰ／ＢＰ患者的ＢＣＲ．ＡＢＬ激酶区基因突 变，对于指导患者临床用药具有重要价值。 参考文献： ［１］ ＲＯＷＬＥＹ Ｊ Ｄ．Ｌｅｔｔｅｒ：ａ ｎｅｗ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ｂｙ ｑｕｉｎａｅｒｉｎｅ ｆｌｕｏｒｅｓ— ｅｅｎｅｅ ａｎｄ Ｇｉｅｍｓａ ｓｔａｉｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９７３，２４３（５４０５）：２９０— ２９３． ［２］ ＧＲＯＦＦＥＮ Ｊ，ＳＴＥＰＨＥＮＳＯＮ Ｊ Ｒ，ＨＥＩＳＴＥＲＫＡＭＰ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｐｈｉｌａ— ｄｅｌｐｈｉａ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ ａｒｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ａ ｌｉｍｉｔｅｄ ｒｅ— ｇｉｏｎ，ｂｃｒ，ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２２［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９８４，３６（１）：９３．９９． ［３］ＤＲＵＫＥＲ Ｂ Ｊ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｉｎｔｏ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＣＭＬ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，２００８，１１２（１３）：４８０８－４８１７． ［４］ ＳＨＡＲＭＡ Ｐ，ＭＯＨＡＮＴＹ Ｓ，ＫＯＣＨＵＰＩＬＬＡＩ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＡＢＬ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｆｅｒｉｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ－ｒｆｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ［Ｊ］．Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ，２０１０，５１（６）：１０７２—１０７８． ［５］ ＳＯＶＥＲＩＮＩ Ｓ，ＤＥ ＢＥＮＥＤＩＴＴＩＳ Ｃ，ＰＡＰＡＹＡＮＮＩＤＩＳ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ＢＣＲ－ＡＢＬ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｍａ－－ ｔｉｎｉｂ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｅｒａ：ｔｈｅ ｍａｉｎ ｃｈａｎｇｅｓ ａｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｙｐｅ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ，２０１４，１２０（７）：１００２—１００９． ［６］ 张之南．血液病诊断及疗效标准［Ｍ］．北京：科学出版社， ２００７：９１１－９１７． ［７］ 朱平，夏君燕，刘红星，等．我国２１０例伊马替尼耐药慢性髓细 胞白血病和Ｐｈ阳性急性淋巴细胞白血病ＡＢＬ１基因突变特征 ［Ｊ］．中华检验医学杂志，２０１２，３５（Ｉ）：１７－２２． ［８］ＱＩＮ Ｙ ｚ，ＣＨＥＮ Ｓ Ｓ，ＪＩＡＮＧ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＢＣＲ—ＡＢＬ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｉｍａｔｉｎｉｂ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｈｒｏｎ－ ｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ，２０１１，９０（Ｉ）：４７— ５２． ［９］ＫＩＭ Ｓ Ｈ，ＫＩＭ Ｄ，ＫＩＭ Ｄ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｃｒ－Ａｂｌ ｋｉｎａｓｅ ｄｏ— ｍａｉｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｋｏｒｅａｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｐｏｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ Ｐ－ｌｏｏｐ ａｎｄ Ｔ３ １５Ｉ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｈａｓｅ ｄｅ－ ｐｅｎｄｅｎｔ［Ｊ］．Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ，２００９，２７（４）：１９０－１９７． ［１０］ ＳＯＶＥＲＩＮＩ Ｓ，ＣＯＬＡＲＯＳＳＩ Ｓ，ＧＮＡＮＩ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＡＢＬ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｉｍａｔｉｎｉｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ—ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｂｙ ｔｈｅ ＧＩＭＥＭＡ Ｗｏｒｋ— ｉｎｇ Ｐａｒ【ｙ ｏｎ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２００６，１２（２４）：７３７４－７３７９． ［１１］ＥＬＩＡＳ Ｍ Ｈ，ＢＡＢＡ Ａ Ａ，ＡＺＬＡＮ Ｈ，ｅｔ ａ１．ＢＣＲ・ＡＢＬ ｋｉｎａｓｅ ｄｏ— ｍａｉｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ２ ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｍａｔｉｎｉｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｍａｌａｙｓｉａｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ－－ｒｆｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｅｌｉｎｉ－－ ｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ［Ｊ］．Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ，２０１４，３８（４）：４５４－４５９． ［１２］ＢＥＮＧＩＯ Ｒ Ｍ，ＲＩＶＡ Ｍ Ｅ，ＭＯＩＲＡＧＨＩ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｍａｔｉｎｉｂ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｄｏ ＢＣＲ－ ＡＢＬ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｆｆｅｃｔ ｐａｔｉｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ？Ｆｉｒｓｔ ｍｕｌｔｉ— ｃｅｎｔｅｒ Ａｒｇｅｎｔｉｎｅａｎ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ，２０１１，５２（９）： １７２０．１７２６． ［１３］ＷＥＩＳＢＥＲＧ Ｅ，ＭＡＮＬＥＹ Ｐ Ｗ，ＢＲＥＩＴＥＮＳＴＥＩＮ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒ－ ａｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＭＮ１０７，ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ Ｂｃｒ－Ａｂｌ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２００５，７（２）：１２９—１４１． ［１４］ ＲＥＤＡＥＬＬＩ Ｓ，ＰＩＡＺＺＡ Ｒ，ＲＯＳＴＡＧＮＯ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂｏｓｕ— ｔｉｎｉｂ，ｄａｓａｔｉｎｉｂ，ａｎｄ ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ ａｇａｉｎｓｔ １ ８ ｉｍａｔｉｎｉｂ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＢＣＲ／ ＡＢＬ ｍｕｔａｎｔｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２００９，２７（３）：４６９－４７１． （本文编辑：孟月英文编辑：孟月）
