维普资讯 http://www.cqvip.com ・６１４・ ２００７年８月第１２卷第８期Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃ ！ ！ ！ ： ：！ ： ： ： 急性非淋巴细胞性白血病骨髓白血病 细胞Ｂ７分子和ＨＬＡ—ＤＲ的检测 ７３００５０ 兰州 兰州军区兰州总医院全军血液病中心 白 海，马晓慧，王存邦，张 茜，徐淑芬，欧建峰，路继红 【摘要】 目的：检测急性非淋巴细胞性白血病患者骨髓白血病细胞表面ＭＨＣ一Ⅱ分子和Ｂ７共刺激分子的表达情况。 方法：采集分离３４例初诊或复发的急性非淋巴细胞性白血病患者骨髓细胞，其骨髓中原始细胞比例＞７０％。应用结合有荧光 ＰＥ或ＦＩＴＣ的单克隆抗体标记骨髓细胞，用流式细胞仪进行ＨＬＡ—ＤＲ、ＣＤ８０（Ｂ７—１）和ＣＤ８６（Ｂ７—２）免疫标记检测。结果：３４例 患者除Ｍ３型外，ＨＬＡ．ＤＲ抗原的表达均较高，其中Ｍ２型最高，为（８Ｏ．１４±９．０７）％；ＣＤ８０阳性率均很低，最高为Ｍ１型，为 （６．３４±１．１２）％，其余均在１％～４％之间；ＣＤ８６的表达高于ＣＤ８０，最高为Ｍ５型，为（３２．６０±４．１８）％，最低为Ｍ６型，为 （１２．３４±２．３６）％。结论：急性非淋巴细胞性白血病细胞表面共刺激分子表达以ＣＤ８０减低或缺乏为主。 【关键词】 急性非淋巴细胞性白血病； 共刺激分子； Ｂ７—１； Ｂ７—２； ＨＬＡ—ＤＲ 中图分类号：Ｒ７３３．７１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９—０４６０（２００７）０８—０６１４—０３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ Ｂ７ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ＨＬＡ－ＤＲ ｏｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ 鲋，Ｈａｉ，ＭＡ Ｘｉａｏ－ｈｕｉ，ＷＡＮＧ Ｃｕｎ－ｂａｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｑｉａｎ，ｘｕ Ｓｈｕ－ｆｅｎｇ，ＯＵ Ｊｉａｎ－ｆｅｎｇ， ｔｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｌａｎｚｈｏｕ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐ ，Ｌａｎｚｈｏｕ ７１００５０，Ｃｈｉｎａ Ｊｉ－ｈｏｎｇ．Ｈｅｍａ－ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ一Ⅱａｎｄ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｎ ａｃｕｔｅ ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ （ＡＮＬＬ）ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｂｏｎｅ ｍａ￣ｏｗ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ７０％ｌｅｕｋｅｍｉａ ｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ３４ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＡＮＬＬ ｉｎ ｐｒｉ— ｍａｒｙ ｓｔａｇｅ ｏｒ ｒｅｌａｐｓｅ ｓｔｇｅ．Ｔｈｅ ｓａａｍｐｌｅｓ ａｆｔｅｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＰＥ ｏｒ ＦＩＴＣ ａｎａｌｙｚｅｄ ＨＬＡ－ＤＲ、 ＣＤ８０（Ｂ７—１）ａｎｄ ＣＤ８６（Ｂ７—２）ｏｎ ｔｈｅｓｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＦＡＣＳｃａｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ・ＤＲ ｗａｓ ｈｉｇｈ ｉｎ ａｌｌ ｂｕｔ ＡＮＩ上一Ｍ３ ｉｎ ３４ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＡＮＬＬ，ａｎｄ ＡＮＬＬ－Ｍ２ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ，ａｂｏｕｔ（８Ｏ．１４±９．０７）％．Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＣＤ８０ ｗａｓ ｌｏｗ ａｂｏｕｔ（６．３４±１．１２）％ ｏｎ ＡＮＬＬ—Ｍ１ ａｎｄ １％－４％ｉｎ ｏｔｈｅｒ ｇｒｏｕｐｓ．ＣＤ８６ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ（３２．６０±４．１８）％ｉｎ ＡＮＬＬ—Ｍ５ ａｎｄ（１２．３４ ４－２．３６）％ｉｎ ＡＮＬＬ－Ｍ６． Ｃｏｎｄｕｓｉｏｎ：Ｉｎ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｙ ｍｏｌｒｅｃｕｌｅｓ ｏｆ ＡＮＬＬ ｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ，ＣＤ８０（Ｂ７—１）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｍａｉｎｌｙ ｌｏｗ ｏｒ ａｂｓｅｎｔ． 【Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ】Ａｃｕｔｅ ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ；Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；Ｂ７—１；Ｂ７—２；ＨＩＪＡ—ＤＲ Ｔ细胞激活需要两个信号参与，一个是抗原特 异性的，通过Ｔ细胞受体和抗原一主要组织相容性 复合物（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）相互 作用来传递；另一个是抗原非特异性的，通过共刺激 分子及其受体相互作用传递。Ｂ７是迄今为止发现 的最重要的共刺激分子家族，包括两个主要成员 Ｂ７—１和Ｂ７—２，在激活Ｔ淋巴细胞，发挥抗肿瘤免疫 １资料与方法 １．１一般资料急性非淋巴细胞性白血病（ＡＮＬＬ ）患者３４例，男性２２例，女性１２例；年龄１３～６７ 岁，中位年龄３２岁；按ＦＡＢ标准分类：Ｍｌ和Ｍ３型 各５例、Ｍ２、Ｍ５型各９例，Ｍ４型４例，Ｍ６型２例。 每例患者均进行了细胞形态学、细胞遗传学、免疫学 和分子遗传学诊断。标本采集来自初诊或复发患 者，患者骨髓中白血病细胞大于７０％。 １．２试剂与仪器试剂：ＰＥ标记和ＦＩＴＣ标记的单 克隆抗体均为Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ公司产品。主要仪器：流 式细胞仪（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ，美国ＢＤ公司）。 １．３ 标本采集和检测 从髂后上棘抽取骨髓２ｍｌ， 中具有重要的作用。共刺激分子的缺乏，是肿瘤逃 避免疫作用的重要机制之一¨。 。本研究应用流式 细胞仪技术，检测了急性非淋巴细胞白血病（ＡＮ— ＬＬ）患者细胞表面ＨＬＡ—Ｉ１分子和Ｂ７分子的表达 情况。 维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７年８月第１２ 第８期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ｕｇ．至 ！ ！： ： ・６１５・ 肝素钠抗凝，用Ｆｉｃｏｌｌ—Ｈｙｐａｑｕｅ液分离骨髓单个核 细胞，ＰＢＳ缓冲液漂洗，将细胞悬液调至１×１０ ／ ｍ１。每次取细胞悬液１００￣１，分别加入荧光标记的 数据分析。数据以ｘ ４－ｓ表示，组间比较用￡检验和 方差检验。 ２结 果 单抗，其中包括ＦＩＴＣ结合的抗人ＨＬＡ—ＤＲ（Ｌ２４３， ＢＤ）、ＦＩＴＣ结合的抗人ＣＤ８０（Ｂ７—１，ＢＢ）、ＰＥ结合的 ２．１ 白血病标本ＭＨＣⅡ类抗原ＨＬＡ—ＤＲ的表达 抗人ＣＤ８０、ＦＩＴＣ结合的抗人ＣＤ８６和ＰＥ结合的抗 人ＣＤ８６等，温度２２～２５ｃＩ＝，避光孵育１５～２０ｍｉｎ， ３４例患者中，除Ｍ３型外，标本ＭＨＣ ＩＩ类抗原ＨＬＡ— ＤＲ的阳性表达均较高，其中Ｍ２型最高，ＨＬＡ—ＤＲ 阳性表达为（８０．１４±９．０７）％。按骨髓标本中表面 标记的阳性细胞百分比大于２０％为阳性病例，可见 Ｍ１、Ｍ２、Ｍ４和Ｍ５型患者均为阳性病例，而Ｍ３和 Ｍ６型阳性病例数较少。说明ＨＬＡ．ＤＲ抗原在ＡＮＬＬ 各亚型中的表达虽然存在差异（Ｐ＜０．０５），但在大 部分亚型中的表达较高。参见表ｌ、表２。 ＰＢＳ缓冲液冲洗，１ ０００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，去上清，加 １ｍｌ的１％多聚甲醛固定液，用流式细胞仪进行检测 分析。与对照抗体比较，结果用荧光阈值强度计算 阳性细胞百分比，如果骨髓标本中表面标记的阳性 细胞百分比大于２０％，被定义为阳性病例。 １．４统计学方法用Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ软件行 表１ ＨＬＡ—ＤＲ和Ｂ７分子在急性非淋巴细胞性白血病骨髓白血病细胞的表达（元±ｓ，％） 注： 与其它组比较，Ｐ＜０．０５；一与Ｍ２和Ｍ５组比较，Ｐ＜０．０５ ２．２ 白血病标本共刺激分子的表达如表１，在３４ 解率和治愈率。近年来，随着Ｔ细胞激活及其Ｔ细 表２在急性粒细胞白血病中白血病细胞表面标记 阳性率＞２０％的病例数 例患者中，ＣＤ８０阳性率很低，最高为Ｍ１型，只有 （６．３４±１．１２）％，其余均在１％～４％之间，ＣＤ８６ 的表达高于ＣＤ８０，最高为Ｍ５型，为（３２．６０± ４．１８）％，最低为Ｍ６型，为（１２．３４±２．３６）％。本组 中，无１例患者白血病细胞中ＣＤ８０阳性细胞数大 于白血病细胞总数的２０％，而ＣＤ８６阳性病例数为 １５例，其中Ｍ４型为３／４例，Ｍ５型均为５／９例，Ｍ６ 型为０／２例（表２）。白血病标本Ｂ７分子的表达检 测结果说明白血病细胞表面共刺激分子表达以 ＣＤ８０（Ｂ７—１）减低为主。 ３讨论 急性非淋巴细胞性白血病是一类造血干／祖细 胞与肿瘤细胞相互作用的分子机制研究的深入［ ， 其免疫治疗有望成为另一种有效治疗白血病的 方法。 胞性恶性克隆性疾病，发生在造血干／祖细胞不同分 化阶段。联合化疗是现阶段的主要治疗方法，但化 疗完全缓解的患者的根治率不到５０％ ，因而有必 要寻求一种新的白血病治疗方法，以提高患者的缓 在肿瘤的动物实验中，应用许多外源基因转染 进入肿瘤细胞的方法均可成功诱导抗肿瘤免疫，这 维普资讯 http://www.cqvip.com ・６１６・ ２００７年８月第１２卷第８期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃ ： Ｚ： ！： ： ： 些基因包括ＭＨＣ分子、病毒抗原、免疫调节细胞因 子如ＩＬ一２、ＧＭ—ＣＳＦ、ＩＦＮ一 和共刺激分子如Ｂ７—１ （ＣＤ８０）和Ｂ７－２（ＣＤ８６）等 。用Ｂ７—１基因转染的 肿瘤细胞如ＲＭＡ、ＥＩＡ、Ｐ８１５、Ｅ６Ｂ２和Ｋ１７３５等细 胞系。结果可产生对原肿瘤细胞的保护性免疫 。 最近也有实验证明在Ｐ８１５细胞转染Ｂ７－２基因可 以产生与Ｂ７—１相同的作用。还有研究证明，单独导 人Ｂ７—１无效的肿瘤细胞，可以通过ＩＣＡＭ一１ ｃＤＮＡ 超级转染产生有效的抗肿瘤免疫 。 血液系统肿瘤一般表达高水平的ＭＨＣ Ｉ和 ＭＨＣ １１，并且已证明在某些情况下可以提呈肿瘤抗 原，所以血液肿瘤是最好的研究Ｂ７—１作用的免疫基 因治疗的模型。Ｉｍａｉ等 报告用Ｂ７—１基因修饰的 ＢＣＲ／ＡＢＬ基因转染髓性细胞，可在同系小鼠产生抗 白血病的保护性免疫。因共刺激分子Ｂ７—１、Ｂ７－２及 ＩＣＡＭ一１表达在起源于骨髓细胞的专职抗原提呈细 胞（ＡＰＣ）上，所以同样起源于骨髓细胞的人类白血 病细胞可能本身也可表达共刺激分子。确定各类型 的白血病细胞表达共刺激分子的程度，对进行Ｂ７ 介导的白血病的免疫基因治疗具有指导作用。 本文用流式细胞仪检测了急性非淋巴细胞白血 病细胞ＭＨＣ１１、Ｂ７—１和Ｂ７－２分子的表达。发现除 Ｍ３和Ｍ６外，ＨＬＡ—ＤＲ在所有类型的ＡＮＬＬ中均高 表达，所以在ＡＮＬＬ中，缺乏ＨＬＡ表达不是免疫逃 逸的机制，相反由于ＣＤ８０（Ｂ７—１）表达低甚至缺乏， 可能其在诱导ＡＮＬＬ细胞免疫刺激方面更为 重要 。 总之，ＣＤ８０（Ｂ７—１）低表达可能与ＡＮＬＬ白血病 细胞的免疫逃逸有关，在临床上表现为在ＡＮＬＬ异 基因干细胞移植后白血病复发的患者，应用供者淋 巴细胞输注（ＤＬＩ）治疗时，效果明显较同样情况时 慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）差。因此有可能通过体 外培养，提高共刺激分子如ＣＤ８０的表达；或在体内 有可能通过应用细胞因子，如ＧＭ—ＣＳＦ或ＩＦＮ一 上 调共刺激分子的表达，而提高ＡＮＬＬ对Ｔ细胞介导 的免疫治疗的敏感性，提高白血病的Ｉ临床疗效。 参考文献 ［１］ Ｗｈｉｔｅｗａｙ Ａ，Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｔ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｏ－ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｂｌａｓｔｓ ｍａｙ ｅｆｆｅｃｔ ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆｆｉｒｓｔ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ［Ｊ］，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏ［，２００３，１２０ （３）：４４２—４５１． ［２］ 马肖容，张，陈银霞，等．急性白血病细胞Ｂ７—１及ＭＨＣ 分子的表达［Ｊ］．第四军医大学学报，２００３，２４（１３）：１２１６ —１２１７． ［３］Ｔａｌｌｍａｎ ＭＳ．Ｎｅｗ ｓｔｒａｔ ｅｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅ－ ｍｉａ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｎｏｖｅｌ ａｇｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ （Ａｍ Ｓｏｃ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｅｄｕｃ Ｐｒｏｇｒａｍ），２００５，２００５（１）：１４３—１５０． ［４］ Ｎｏｎｅｒ Ｍ，Ｗｉｌｌｉｎｇｅｒ Ｔ，Ｅｒｂｅｎ Ｕ，ｅｔ ａ１．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａ Ｂ７－１ （ＣＤ８０）ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕ— ｋｅｍｉａ ｂｌｓａｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅｉｒ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｅｒｍｉｓｓｉｏｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，２００１，９７（１０）：３１３８—３１４５． ［５］Ｇｒａｆ Ｍ，Ｒｅｉｆ Ｓ，Ｈｅｃｈｔ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｓｔｉｍｕｌａ－ ｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｒｅｌａｐｓｅ—ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＡＭＬ）［Ｊ］．Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ，２００５，８４ （５）：２８７—２９７． ［６］Ｉｍａｉ Ｃ，１ｗａｍｏｔｏ Ｓ，Ｃａｍｐａｎａ Ｄ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｏｖｅ￣ｏｍｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｐｅ— ｃｉｉｆｃ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，２００５，１０６（１）：３７６ —３８３． ［７］ Ｖｅｒｅｅｃｑｕｅ Ｒ，Ｓａｕｄｅｍｏｎｔ Ａ，Ｑｕｅｓｎｅｌ Ｂ．Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕ－ ｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００４，１８（７）：１２２３—１２３０． ［８］Ｍａｅｄａ Ｔ，Ｔｏｗａｔａｒｉ Ｍ，Ｋｏｓｕ￣Ｈ，ｅｔ １ａ．Ｕｐ．ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｓｔｉｍ． ｕｌａｔｏｒｙ／ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌｓａｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ａ— ｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，２０００，９６（１２）：３８４７ —３８５６． 收稿日期：２００６—１１—２１；修回日期：２００７—０３—０６
