分离纯化

材料试剂和器具 3.1试剂

3.1.1 金氏B(king medium B)培养基配方如下：

蛋白胨 20g，磷酸氢二钾 1.5g，硫酸镁 1.5g，琼脂 10g，无菌水1000ml。 pH值 7.2±0.2 。

3.1.2十六烷基三甲基溴化铵琼脂配方如下

蛋白胨 10g；牛肉浸粉 3g；氯化钠 5g；琼脂 13g；十六烷基三甲基溴化铵 0.3g；pH7.5± 0.1

。 3.1.3器具

移液，试管，锥形瓶，量筒，天平，钥匙，剪刀，锡纸，标签纸，线绳，酒精灯，石棉网，借种环，培养皿等。 3.3材料 番茄根部

King’s B medium

用途： 用于铜绿假单菌产荧光色素试验

蛋白胨 20.0 磷酸氢二钾 1.5 硫酸镁 配方：（g/L） 1.5 琼脂 15.0 pH值 25 ℃ 7.2±0.2 蛋白胨提供氮源；磷酸盐促进荧光素的产生并抑制绿脓色素的

原理： 产生；硫酸镁为荧光素的产生提供必须的阳离子；琼脂是培养

基的凝固剂。

4.1.2十六烷基三甲基溴化铵琼脂配制

成分（单位：g/L）

蛋白胨 10；牛肉浸粉 3；氯化钠 5；琼脂 13；十六烷基三甲基溴化铵 0.3；pH7.5± 0.1

用法 取32g琼脂粉末，加1L蒸馏水，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min。冷却至55℃，倾注灭菌平皿。 说明 十六烷基三甲基溴化铵属阳离子表面活性剂，有较强的杀菌作用。主要是改变细菌细胞的通透性，使菌体内的氯、磷和其他物质逸出，细菌发生自溶。亦能使菌体蛋白质变性沉淀，从而导致细菌死亡。在一定浓度下，此培养基抑制大肠埃希氏菌生长，并使革兰氏阳性菌生长差。对铜绿假单胞菌无抑制作用，表现有很强的选择性。

4.1.4倒平板

待其冷却至 45 ℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成平板。这次实验需要配制KB培养基16个，十六烷基三甲基溴化铵琼脂3个。

倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将轻轻地拨出，瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管瓶塞(也可将瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约 15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。 4.1.4无菌捡查

将灭菌培养基放人=温室中培养24-48h，以检查灭菌是否彻底

4.2荧光假单胞杆菌的分离

4.2.1 制备土壤稀释液

取番茄根部，抖落土壤，直至仅剩下粘连在根部的极少部分土壤即为本次实验的根际土。有酒精擦拭剪刀消毒，剪去根部，将带土的根部放入盛9ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，定容至10ml。振摇约20min，使根际土与水充分混合，将细胞分散。 4.2.2 涂布 （在接种室或者超净工作台内进行）

在十六烷基三甲基溴化铵琼脂和KB平板底面分别用记号笔写上1、2 。取菌液1-2ml。小心地滴在对应平板培养基表面位置。用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。 4.2.3 培养

将上述两个培养基置于20℃温室中培养1～2d。 4.2.4 挑菌落

将培养后挑选橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠,边缘整齐的菌落；再在紫外灯下进行经一步的挑选。（注：如果本次实验中如果出现整个平板菌落连成一片的情况，就需要稀释菌液10-100倍重复上述操作）用接种针，挑取少量的目的菌于试管的液体KB培养基中培养。

4.2.5 平板划线纯化

将平板倒置于酒精灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，盖稍微打开，右手拿接种环，以无菌操作蘸取一环菌悬液，在平板一边划第一道平行线2-3。划完后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。 转动培养皿70°，待环冷却后，从第一道线划过做第二次划线，同样方法，划出第三第四道平行线。

恒温培养：将划线平板倒置，于 28℃ 培养，1d后观察（若分离结果不理想，重复划线纯化，直到得到单一菌落）

4.3荧光假单胞杆菌的增殖培养 4.3.1涂布

取少量目的菌种于无菌水中，充分振摇。取菌液1-2ml。小心地滴在KB平板培养基表面位置。用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基. 4.3.2培养

置于28℃温室中培养1～2d。 5.注意事项

5.1称药品时，牛角匙不要混合用。。要根据不同的培养基注意不同的操作 5.2若配置液体培养基，不需要加入琼脂。

5.3分离纯化要在接种室或者超净工作台内进行。

5.4 制备无菌水时，要把容器的盖子松开，以免在灭菌过程中撑破试管。 5.5在高温蒸汽灭菌先排冷空气以让蒸汽充满整个高压锅。

5.4蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把钥匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。 附：平板划线操作