纳米银抑菌机理研究方案
纳米银对细菌有抑制作用，但具体机理并不清楚。
目前已有很多学者根据纳米银对细菌抑制作用的宏观现象，提出纳米银对细菌抑制机理的推测，如纳米银可能影响微生物细胞的呼吸系统，损伤DNA，破坏细胞膜等。但对细胞壁等方面研究很少。
我们将设计实验阐明纳米银对细菌有抑制作用的具体机理。研究的主要内容包括纳米银对细胞壁的破坏的机理，对细胞膜的损害，对细胞呼吸链酶的影响，对DNA损伤等方面，从而明确纳米银对细菌的抑制作用的机理。
实验步骤 1抑菌试验方法
1.1抑菌率实验
用系列稀释法制得胶体银溶液浓度为10 ppm、20 ppm、40 ppm、80 ppm、100 ppm 的PBS 缓冲液，加入0.2 mL 菌悬液(大肠菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉，最终培养基中菌液浓度为1×106 cfu/mL)，作用20min．然后取1 mL 混合液投入到9 mL 的PBS 缓冲液中，做系列稀释，取其中3 个稀释度，吸取0.5 mL 置于平皿中迅速用凉至40~45 ℃的营养琼脂培养基15 mL 作倾注，转动平皿，使得稀释液与培养基充分混匀，琼脂凝固后翻转平皿，37 ℃培养24 h 进行菌落计数。
抑菌率计算方法 公式：X=(A-B)/A×100％
其中：X——抑菌率，A——对照样品中的平均菌落数，B——被试样品的平均菌落数． 1.2抑菌圈实验
在超净工作台内，将灭菌后的营养琼脂培养基倒入已灭菌的培养皿中，制成平板，用可
调式移液器移取 1mL 浓度为 10+8cfu/L 的大肠杆菌于无菌的琼脂平板上， 5min 后，每个牛津杯中加入 20μL 纳米银溶胶，置于 37℃恒温培养箱中培养 24h。在菌体生长的同时，样品试液均匀扩散到琼脂平板上，抑制其周围的微生物生长，从而产生不长菌的透明抑菌圈。按互成 60°的 3 个直径方向测量透明抑菌圈直径，计算平均值，从而测量出大肠杆菌纳米银作用下的抑菌圈大小。在相应培养基上以相同的方法测量其它六种菌株的抑菌圈的大小。与细菌不同的是应该将10+7cfu/L 酵母菌涂布在 YEPD 固体培养基上，放置在 28℃恒温培养箱中培养 48h。 2. 1纳米银对细胞膜和细胞壁影响
2.1.1采用透射电镜观察了经纳米银粒子处理过的大肠杆菌细胞的形态变化过程,观察细胞膜和细胞壁的结构变化
2.1.2通过革兰氏染色判断细菌经纳米银处理前后，细胞壁是否发生变化
2.1.3测定纳米银处理前后MDA含量的变化，丙二醛（MDA）是常用的膜质过氧化指标，判断膜质过氧化情况。
2.1.4测定乳酸脱氢酶(LDH) 浓度，乳酸脱氢酶(LDH)是存在于细胞浆内参与糖酵解最后一步即丙酮酸和乳酸相互转化时的一种转化酶，正常情况下，胞外含有少量，但在细胞受损的情况下，就会由细胞漏出至胞外。判断纳米银是否引起细胞膜破裂。菌悬液加入10mmol/了的葡萄糖和纳米银温育，间隔10min取样，用0.22um孔径的无菌纤维素膜过滤，滤液测胞外乳酸脱氢酶含量和紫外吸收物质。紫外吸收物质在260nm下测定光吸收值。 2. 2 纳米银对DNA的影响
2.2.1用纳米银处理大肠杆菌DNA，通过琼脂糖凝胶电泳观察前后变化。（通过电镜观到经纳米银粒子处理过的大肠杆菌细胞,DNA 不再随机分布在细胞的核区,而是在核区浓缩紧张态的现象）
2.2.3观察纳米银处理后细菌核区的变化(纳米银使大肠杆菌DNA 不再随机分布在细胞的核区，而是在核区浓缩呈紧张态，并增加菌体内总DNA 的降解程度) 2. 3 纳米银对蛋白质的影响
2.3.1通过蛋白凝胶电泳观察对蛋白质的影响。
2.3.2（纳米银颗粒在水或体液中可以释放A扩，而A扩与含琉基(一sH)的大分子有很强的结合力，可使微生物失活）将较高浓度牛血清白蛋白加入到纳米银胶体中，紫外一可见吸收光谱谱锋明显红移，且吸光度值随BSA浓度增加而下降，表明纳米银颗粒与蛋白质发生直接的相互作用
2.4纳米银对呼吸链酶的影响
苹果酸脱氢酶粗酶液的制备
将金黄色葡萄球菌培养至对数期，按2%接种量加入到SI 终浓度为0.8 mg·ml-1 的50 ml 肉汤培养基中，以不加SI 组为对照，37℃，120 r/min 摇床中振荡培养。待培养到8、12、16、20、24、28、32、36、40 h 后，分别将菌悬液于6 000 r/min 离心10 min，弃上清，双蒸水洗涤3次，再用双蒸水将其分别配制成OD580 为0.6 的菌悬液。然后取该菌悬液各10 ml，6 000 r/min 离心10 min，弃上清，用缓冲液（0.1 mol·L-1 Tris-Hcl，20 mmol·L-1KCl，5 mol·L-1 MnSO4，2 mmol·L-1 DTT，0.1 mmol·L-1EDTA，pH7.0）洗涤2 次后，悬浮于10 ml 缓冲液中。用超声波破碎仪（破碎强度为80%）将菌体破碎，每次10 S，间隔30 S，循环10 次，共计7 min，12 000 r/min离心15 min，除去细胞碎片，上清液即为粗酶液，于－20℃冰箱中保存，用于酶活力的测定。上述试验均在冰浴中进行。
苹果酸脱氢酶比活性的测定
将2.5 ml 0.1mol·L-1 Tris-HCl（pH 8.8），0.1 ml 0.1 mmol·L-1 sodiummalate（苹果酸钠），0.1 ml 10 mmol·L-1 NAD+[17]的混合物顺次加入石英比色皿中，然后快速加入0.3 ml 粗酶液
引发反应。每隔0.5 min，在340 nm 用可见光—紫外分光光度计连续测定3 min，以A340nm 为纵坐标,时间t（min）为横坐标作图，取反应过程中的线性部分，计算A340nm/min 的增加值。以每分钟A 值增加0.01为1 个酶活力单位。以小牛血清蛋白为对照，测定粗酶液中苹果酸脱氢酶的含量，按照下列公式求出苹果酸脱氢酶的比活性
(U·mg-1·min-1)=（ ΔA/0.01）/(Reaction time (min)×protein content of sample (0.3 ml))
