超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法测定茶叶中黄酮醇糖苷种类及含量

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２１ꎬ３７(１):２０４￣２１２

ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ

２０２１ꎬ３７(１):２０４￣２１２.

董　方ꎬ张群峰ꎬ阮建云.超高效液相色谱￣三重四级杆串联质谱法测定茶叶中黄酮醇糖苷种类及含量[Ｊ].江苏农业学报ꎬｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２１.０１.０２７

超高效液相色谱￣三重四级杆串联质谱法测定茶叶中黄酮醇糖苷种类及含量

董　方１ꎬ２ꎬ　张群峰２ꎬ　阮建云２

(１.江西省农业科学院园艺研究所ꎬ江西南昌３３０２００ꎻ２.中国农业科学院茶叶研究所ꎬ浙江杭州３１０００８)

　　摘要:　基于超高效液相色谱￣三重四级杆串联质谱(ＵＰＬＣ￣ＱｑＱ￣ＭＳ/ＭＳ)联用技术对茶叶中黄酮醇糖苷(ＦＧｓ)

种类及含量进行测定并对提取方式和检测条件进行优化ꎮ用７５％(体积分数)甲醇水溶液提取目标化合物ꎬ再用ＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＨＳＳＴ３色谱柱(粒径为１􀆰８μｍꎬ长度×内径为１００.０ｍｍ×２􀆰１ｍｍ)分离目标化合物ꎬ以含有０.１％(体积分数)甲酸的乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱ꎬ采用电喷雾正离子源(ＥＳＩ＋)与质谱多反应监测(ＭＲＭ)方法对成品茶中１５种ＦＧｓ进行定量测定ꎮ结果表明ꎬ在０.１~２０􀆰０μｇ/ｍｌ的质量浓度范围内ＦＧｓ的基质标准曲线的线性关２􀆰８０％ꎬ出峰时间为３.６０~７􀆰４０ｍｉｎꎮ与现有最优检测技术相比ꎬ超高效液相色谱￣三重四级杆串联质谱法具有分析速度快、灵敏度高、稳定性好等特点ꎬ可为提高茶叶品质成分的检测效率提供参考ꎮ

关键词:　茶叶ꎻ黄酮醇糖苷ꎻ超高效液相色谱￣三重四级杆串联质谱法ꎻ质谱多反应监测ꎻ优化中图分类号:　Ｏ６５８ꎻＴＳ２７２　　　文献标识码:　Ａ　　　文章编号:　１０００￣４４４０(２０２１)０１￣０２０４￣０９系良好ꎬ其检测限(ＬＯＤ)为０.０８~０􀆰２３μｇ/Ｌꎬ定量限(ＬＯＱ)为０.２５~０􀆰７６μｇ/Ｌꎬ相对标准偏差(ＲＳＤ)为１.３０％~

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｉｎｔｅａｓｂｙｕｌｔｒａ￣ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑ￣ｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｔｒｉｐｌｅｆｏｕｒ￣ｂａｒｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃ￣ｔｒｏｍｅｔｒｙ

ＤＯＮＧＦａｎｇ１ꎬ２ꎬ　ＺＨＡＮＧＱｕｎ￣ｆｅｎｇ２ꎬ　ＲＵＡＮＪｉａｎ￣ｙｕｎ２

ｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＨａｎｇｚｈｏｕ３１０００８ꎬＣｈｉｎａ)

(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＪｉａｎｇｘｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｃｈａｎｇ３３０２００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＴｅａＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌ￣

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ:　Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ(ＦＧｓ)ｉｎｔｅａｓｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂａｓｅｄｏｎｕｌｔｒａ￣ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｔｒｉｐｌｅｆｏｕｒ￣ｂａｒｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ(ＵＰＬＣ￣ＱｑＱ￣ＭＳ/ＭＳ)ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬａｎｄｔｈｅｖａｒｉｅｔｉｅｓａｎｄｃｏｎｔｅｎｔｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ.Ｔｈｅｔａｒｇｅｔｃｏｍｐｏｕｎｄｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｗｉｔｈ７５％(ｖｏｌｕｍｅｆｒａｃｔｉｏｎ)ａｃｉｄａｓｍｏｖｉｎｇｐｈａｓｅ.Ｐｏｓｉｔｉｖｅｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ(ＥＳＩ＋)ａｎｄｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｍｕｌｔｉｐｌｅｒｅａｃｔｉｏｎｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ(ＭＲＭ)ｍｅｔｈ￣ｍｅｔｈａｎｏｌａｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎꎬｓｅｐａｒａｔｅｄｏｎＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＨＳＳＴ３ｃｏｌｕｍｎ(ｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅｗａｓ１􀆰８μｍꎬｌｅｎｇｔｈ×ｉｎｎｅｒｄｉａｍｅｔｅｒｗａｓ

１００.０ｍｍ×２􀆰１ｍｍ)ꎬａｎｄｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｕｓｉｎｇａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅｓｏｌｕｔｉｏｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ０􀆰１％(ｖｏｌｕｍｅｆｒａｃｔｉｏｎ)ｆｏｒｍｉｃｏｄｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅ１５ｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｉｎｍａｄｅｔｅａｓ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｍａｔｒｉｘｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅ

μｇ/Ｌꎬｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｑｕａｎｔｉｔｙ(ＬＯＱ)ｗａｓ０.２５－０􀆰７６μｇ/Ｌꎬｔｈｅｔｈｅｐｅａｋｏｕｔｔｉｍｅｗａｓ３.６０－７􀆰４０ｍｉｎ.Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｅｘ￣ｍｅｔｈｏｄｈａｓｆａｓｔａｎａｌｙｓｉｓｓｐｅｅｄꎬｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｇｏｏｄｓｔａ￣ｂｉｌｉｔｙꎬｗｈｉｃｈｃａｎｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｄｅｔｅｃ￣ｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｔｅａｑｕａｌｉｔｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ.

ｏｆＦＧｓｓｈｏｗｅｄａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｉｔｙｉｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｒａｎｇｅｏｆ０.１－２０􀆰０μｇ/ｍｌꎬｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎ(ＬＯＤ)ｗａｓ０.０８－０􀆰２３

收稿日期:２０２０￣０５￣１４

基金项目:国家重点研发计划项目(２０１６ＹＦＤ０２００９００)ꎻ国家茶产业

技术体系建设专项(ＣＡＲＳ￣１９)

作者简介:董　方(１９９２－)ꎬ男ꎬ陕西西乡人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为

茶树栽培生理与生态ꎮ(E￣mail)183****1752＠１６３.ｃｏｍ

通讯作者:张群峰ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｈｉｌｌ＠ｔｒｉｃａａｓ.ｃｏｍ

ｒｅｌａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎ(ＲＳＤ)ｗａｓ１.３０％－２􀆰８０％ꎬａｎｄｉｓｔｉｎｇｏｐｔｉｍａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＵＰＬＣ￣ＱｑＱ￣ＭＳ/ＭＳ

董　方等:超高效液相色谱￣三重四级杆串联质谱法测定茶叶中黄酮醇糖苷种类及含量２０５

ｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙꎻｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｍｕｌｔｉｐｌｅｒｅａｃｔｉｏｎｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇꎻｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:　ｔｅａꎻｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓꎻｕｌｔｒａ￣ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｔｒｉｐｌｅｆｏｕｒ￣ｂａｒ

　中除儿茶素外较为重要的多酚类物质之一　黄酮醇糖苷(ＦｌａｖｏｎｏｌｓｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓꎬＦＧｓ)ꎬ是茶叶大都由黄酮醇苷元(杨梅素、槲皮素、山柰酚等)或黄酮苷元(芹菜素等)与糖分子(葡萄糖、半乳糖、芸香糖等)结合形成Ｏ￣糖苷[１￣２]对茶叶中的苦涩味及茶汤的光泽度ꎮ已有研究发现、亮度具有重要ꎬＦＧｓ不仅作用[３￣６]物体中发挥着抗氧化ꎬ而且具有类黄酮物质的生理学共性、清除活性氧自由基及抵御紫ꎬ在生

外线、抗菌抑菌等作用[７￣８]国内外有很多ＦＧｓ检测方法的报道ꎮ

ꎬ目前常用的

检测方法主要包括紫外分光光度法ｅｔｅｒ)、(ＵＶｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍ￣

(ＬＣ￣ＭＳ)、高效液相色谱法(ＣＥ)超高效液相色谱法(ＨＰＬＣ)、液相色谱￣质谱检测法一种基于及电化学检测法ＨＰＬＣ系统开发的色谱技术(ＥＤ)等(ＵＰＬＣ)、[９]ꎮ超高效液相色谱是毛细管电泳法ꎬ它充分利用了小粒度色谱柱、超高压液相色谱泵的优势ꎬ能够更灵敏、更快速地实现分离检测ꎬ目前已在茶(ＣａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓＬ.)等多种植物的Ｌ.)、洋葱(ＡｌｌｉｕｍＦＧｓｃｅｐａ检测中得到应用Ｌ.)和银杏(Ｇｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａ[１０￣１２]等[１３]采用ＵＰＬＣ￣ＰＤＡ(超高效液相色谱￣二极管阵列ꎮＫｉｍ)建立了针对荞麦、红茶、野生欧芹ＦＧｓ类化合物的检测方法ꎬ共有１２种ＦＧｓ得到了较好的分离ꎬ但是其含量的线性范围较大ꎬ为０.８８~１４􀆰００ｍｇ/ｋｇꎻＪｉａｎｇ等[１４]首次采用ＵＰＬＣ检测到绿茶、乌龙茶和红茶中１８种ＦＧｓ类化合物ꎬ但是分离时间较长ꎬ为３０~６０ｍｉｎꎻ刘阳等[２]研究了ＦＧｓ在绿茶中的浸出特性ꎬ并基于常规ＨＰＬＣ检测方法ꎬ分离并定量了１１种与茶汤滋味相关性最高的黄酮苷类物质ꎬ但也存在分离时间长、定量准确度低的问题ꎮＵＰＬＣ与ＭＳ/ＭＳ的联用ꎬ已经成为植物化学组分研究的新趋势ꎬ为茶叶中化合物的痕量分析提供了定量保证ꎮ本研究基于多种ＦＧｓ标准品ꎬ在已有研究结果的基础上ꎬ采用超高效液相色谱￣三重四级杆串联质谱法(ＵＰＬＣ￣ＱｑＱ￣ＭＳ/ＭＳ)ꎬ并结合紫外光谱、质谱参数和色谱保留规律ꎬ测定茶叶中ＦＧｓ种类和含量ꎬ以期实现快速分离和准确鉴定茶叶中的ＦＧｓꎮ

１　１.１　材料与方法

材料与试剂

绿茶成品茶(西湖龙井)产自浙江省杭州市西

２１􀆰湖区中国农业科学院茶叶研究所示范园(１２０°５′

清明前３９″Ｅꎬ３０°１０′５７􀆰１芽１叶ꎬ由杭州龙冠实业公司提供１９″Ｎ)ꎬ原料品种为龙井４３ꎬꎻ红茶成选用品茶(滇红金针)产自云南省农业科学院茶叶研究

所科Ｎ)ꎬ研试验基地(１００°２５′５５􀆰叶ꎬ由勐海县云茶科技有限公司提供原料品种为云南勐海大叶种１９″ꎬ选用清明前Ｅꎬ２１°５９′２５􀆰７６″ꎮ

１芽１甲醇(质谱级)、乙腈(质谱级)ꎬ产自德国Ｍｅｒｃｋ公司ꎻ甲酸(色谱级)、杨梅素￣３￣半乳糖苷(Ｍ￣３￣Ｇａ)标准品、杨梅素￣３￣葡萄糖苷(Ｍ￣３￣Ｇ)标准品、槲皮素￣３￣半乳糖苷Ｇ)准品标准品(Ｑ￣３￣Ｇａ)、槲皮素、槲皮素￣３￣葡萄糖￣３￣标准品半乳糖、槲皮素￣鼠李糖苷￣鼠李糖苷￣３￣葡萄糖苷(Ｑ￣３￣ＧＲｈ)(Ｑ￣３￣ＧａＲｈ)(Ｑ￣３￣标准品标、

山柰酚￣３￣半乳糖苷(Ｋ￣３￣Ｇａ)标准品、山柰酚￣３￣葡萄糖苷３￣ＧａＲｈ)(Ｋ￣３￣Ｇ)标准品、山柰酚ＧＲｈ)标准品标准品ꎬ所有标准样品纯度、山柰酚￣３￣葡￣３￣萄半乳糖≥９８％ꎬ糖￣鼠￣李鼠李糖苷糖苷(Ｋ￣３￣(Ｋ￣１.２　Ｓｉｇｍａ仪器与设备

公司ꎻ试验用水为Ｍｉｌｌｉ￣Ｑ超纯水ꎮ

均产自美国

艾卡Ａ１１基本型分析研磨机ꎬ产自德国ＩＫＡ公司ꎻＢＴ１２５Ｄ型电子分析天平ꎬ产自德国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司ꎻＴｈｅｒｍｏＨｅｒａｅｕｓＦｒｅｓｃｏ１７微量冷冻离心机ꎬ产自美国赛默飞世尔科技公司ꎻＫＱ￣５００Ｅ型超声波清洗机ꎬ产自昆山超声波仪器公司ꎻ超高效液相色谱￣三重四极杆ＭＳ￣(ＰＤＡ)/ＭＳμｍꎬ检测器Ｈ￣Ｃｌａｓｓ)ꎬ串联质谱联用仪、Ａｃｑｕｉｔｙ配有ＡＣＱＵＩＴＹ(ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣ￣ＱｑＱ￣ＨＳＳＴ３色谱柱ＵＰＬＣ(二极管阵列粒径为Ｗａｔｅｒｓ柱长×内径为１００􀆰０ｍｍ×２􀆰１ｍｍ)ꎬ产自美国１􀆰８１.３　试验方法公司ꎮ

１.３.１　Ｍ￣３￣ＧＧａＲｈ标准品标准品标准标准溶液的制备品、Ｑ￣３￣Ｇａ标　准确称取准品、Ｑ￣３￣ＧＭ￣３￣Ｇａ标准标准品品、Ｑ￣３￣、、Ｋ￣３￣ＧａＲｈ、Ｑ￣３￣ＧＲｈ标准品标准品、Ｋ￣３￣ＧＲｈ、Ｋ￣３￣Ｇａ标准品标准品ꎬ分别加、Ｋ￣３￣Ｇ

入７５％(体积分数)甲醇溶液振荡超声处理(振荡频率为ｍｉｎ)ꎬ３(配制成质量浓度为０００ｒ/ｍｉｎꎬ超声功率为１􀆰０ｍｇ４０/ｋＨｚꎬｍｌ的母液超声时间为ꎮ用１０质量浓度分别为体积分数)甲醇溶液稀释上述标准品的母液７５％０􀆰１μｇ/ｍｌ、１􀆰０μｇ/ｍｌ、２􀆰０ꎬμｇ配制成/ｍｌ、

２０６江苏农业学报　２０２１年第３７卷第１期

１０􀆰０μｇ/ｍｌ、２０􀆰０μｇ/ｍｌ的标准工作溶液ꎮ

１.３.２　供试样品的前处理　供试样品的前处理方法参照Ｚｈａｎｇ等[１５￣１６]的方法ꎮ取适量成品绿茶、成品红茶ꎬ用研磨机磨碎后精确称取５０ｍｇ磨碎的成品绿茶、成品红茶样品ꎬ分别溶解于１ｍｌ７５％(体积分数)甲醇溶液中ꎬ用最大频率(４０ｋＨｚ)连续超声处理１０ｍｉｎꎬ之后再于１２０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ取５００μｌ上清液ꎬ加入５００μｌ７５％(体积分数)甲醇溶液稀释ꎬ然后过０􀆰２２μｍ聚四氯乙烯(ＰＴＦＥ)滤１.３.３　仪器分析条件　色谱条件:采用ＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＨＳＳＴ３色谱柱(粒径为１􀆰８μｍꎬ柱长×内径为１００􀆰０膜ꎬ用于上机分析ꎬ每种茶设３个重复ꎮ

量为２μｌꎬ紫外(ＵＶ)检测波长为３７０ｎｍꎮ

ｔｅｒｓ公司ꎬ产地为ＭｉｌｆｏｒｄꎬＭＡꎬＵＳＡ)ꎬ使用电喷雾源温度设为１５０℃ꎬ脱溶剂温度设为５００℃ꎬ锥孔气１.４　数据处理

体流速设为５０Ｌ/ｈꎬ脱溶剂气体流速设为８００Ｌ/ｈꎮ

采用ＭａｓｓＬｙｎｘ４.０软件对ＭＳ检测[含多反应监测(ＭＲＭ)]与紫外检测器(ＰＤＡ)检测获得的原始图谱进行质谱峰或紫外光谱峰的提取和积分ꎮ标准曲线的绘制、ＦＧｓ含量的换算采用Ｅｘｃｅｌ２０１０ꎮ

质谱条件:采用ＷａｔｅｒｓＸｅｖｏＴＱ质谱仪(Ｗａ￣

电离源(ＥＳＩ)正离子模式ꎬ毛细管电压设为３.５ｋＶꎬ

ｍｍ×２􀆰１ｍｍꎬ产自Ｗａｔｅｒｓ公司ꎬ产地为美国Ｍｉｌｆｏｒｄ)进行分离ꎮ洗脱条件参照Ｚｈａｎｇ等[１５ꎬ１７]的方法ꎬ流动相Ａ为０.１％(体积分数)甲酸ꎬ流动相Ｂ为乙腈(混有体积分数为０􀆰１％的甲酸)ꎬ洗脱程序:０ｍｉｎꎬ５％乙腈ꎻ

２　结果与分析

２.１　茶叶中黄酮醇糖苷的定性检测

本研究在相同色谱条件、相同质谱条件下对不同茶叶中的黄酮醇糖苷(ＦＧｓ)进行ＵＰＬＣ分析和３.６０~７􀆰４０ｍｉｎ全部洗脱分离ꎬ对应的ＵＰＬＣ色谱图见图１ꎬ根据最大波长吸光度ꎬ利用ＦＧｓ标准品ꎬ结合二级质谱碎片ꎬ并与参考文献[１０]、[１４]、[１７]、[１８]比对ꎬ鉴定出茶叶中１５种ＦＧｓꎬ相关定性参数见表１ꎮＭＲＭ分析ꎬ结果表明ꎬ不同组分的ＦＧｓ化合物在

０.１~３􀆰０ｍｉｎꎬ５％~２０％乙腈ꎻ３.１~４􀆰３ｍｉｎꎬ２０％乙腈ꎻ４.４~９􀆰０ｍｉｎꎬ２０％~４５％乙腈ꎻ９.１~１１􀆰０ｍｉｎꎬ４５％~１００％乙腈ꎻ１１.１~１３􀆰０ｍｉｎꎬ１００％乙腈ꎻ１３.１~１５􀆰０ｍｉｎꎬ４０℃ꎬ样品温度设置为６℃ꎬ流速为０􀆰４ｍｌ/ｍｉｎꎬ进样回到５％乙腈的初始条件ꎮ所有试验的柱温均设置为

１:杨梅素￣３￣葡萄糖￣鼠李糖苷(Ｍ￣３￣ＧＲｈ)ꎻ２:杨梅素￣３￣半乳糖苷(Ｍ￣３￣Ｇａ)ꎻ３:杨梅素￣３￣葡萄糖苷(Ｍ￣３￣Ｇ)ꎻ４:槲皮素￣３￣半乳糖￣鼠李糖￣葡萄糖苷(Ｑ￣３￣ＧａＲｈＧ)ꎻ５:槲皮素￣３￣葡萄糖￣鼠李糖￣葡萄糖苷(Ｑ￣３￣ＧＲｈＧ)ꎻ６:槲皮素￣３￣半乳糖￣鼠李糖苷(Ｑ￣３￣ＧａＲｈ)ꎻ７:槲皮素￣３￣葡萄糖￣鼠李糖苷(Ｑ￣３￣ＧＲｈ)ꎻ８:槲皮素￣３￣半乳糖苷(Ｑ￣３￣Ｇａ)ꎻ９:槲皮素￣３￣葡萄糖苷(Ｑ￣３￣Ｇ)ꎻ１０:山柰酚￣３￣半乳糖￣鼠李糖￣葡萄糖苷(Ｋ￣３￣ＧａＲｈＧ)ꎻ１１:山柰酚￣３￣葡萄糖￣鼠李糖￣葡萄糖苷(Ｋ￣３￣ＧＲｈＧ)ꎻ１２:山柰酚￣３￣半乳糖苷￣鼠李糖苷(Ｋ￣３￣ＧａＲｈ)ꎻ１３:山柰酚￣３￣葡萄糖￣鼠李糖苷(Ｋ￣３￣ＧＲｈ)ꎻ１４:山柰酚￣３￣半乳糖苷(Ｋ￣３￣Ｇａ)ꎻ１５:山柰酚￣３￣葡萄糖苷(Ｋ￣３￣Ｇ)ꎮ

图１　西湖龙井(绿茶)与滇红金针(红茶)中黄酮醇糖苷在３７０ｎｍ波长下的超高效液相色谱(ＵＰＬＣ)结果

Ｆｉｇ.１　Ｕｌｔｒａ￣ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ(ＵＰＬＣ)ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｉｎＷｅｓｔｌａｋｅＬｏｎｇｊｉｎｇ(ｇｒｅｅｎｔｅａ)ａｎｄＤｉａｎ￣

ｈｏｎｇＪｉｎｚｈｅｎ(ｂｌａｃｋｔｅａ)ｄｅｔｅｃｔｅｄａｔｔｈｅｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｏｆ３７０ｎｍ

董　方等:超高效液相色谱￣三重四级杆串联质谱法测定茶叶中黄酮醇糖苷种类及含量

２０７

表１　茶叶中黄酮醇糖苷的定性参数

Ｔａｂｌｅ１　Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｉｎｔｅａｓ

主要二级峰序号

黄酮醇糖苷(ＦＧｓ)　　质荷比(ｍ/ｚ)保留时间(ｍｉｎ)质谱碎片ＭＳ(ｍ//ＭＳｚ)１２Ｍ￣３￣ＧＲｈＭ￣３￣Ｇａ６２６.１５４.２９３１９∗３Ｍ￣３￣Ｇ４８０.０９４.４０３１９∗

４Ｑ￣３￣ＧａＲｈＧ４８０.０９７７２.２１４.４７３１９５６Ｑ￣３￣ＧＲｈＧ７７２.２１４.５２３０３７Ｑ￣３￣ＧａＲｈ∗６１０.１５４.６４３０３８Ｑ￣３￣ＧＲｈ∗Ｑ￣３￣Ｇａ６１０.１５４.７７３０３∗４６４.１０４.９９３０３１０９

Ｑ￣３￣Ｇ

∗

４６４.１０５.１９３０３１１Ｋ￣３￣ＧａＲｈＧ７５６.２１５.３５３０３１２Ｋ￣３￣ＧＲｈＧ７５６.２１５.１２２８７１３Ｋ￣３￣ＧａＲｈ∗５９４.１６５.３５２８７１４Ｋ￣３￣ＧＲｈ∗５９４.１６５.５２２８７１５Ｋ￣３￣Ｇａ∗４４８.１０６.０１２８７４４８.１０

６.０１６.３２

２８７２８７

峰序号与图Ｋ￣３￣Ｇ∗

１相同ꎮ标注“∗葡萄糖￣鼠李糖苷ꎻＭ￣３￣Ｇａ:杨梅素”的表示标准品￣３￣半乳糖苷ꎮꎻＭ￣３￣Ｇ:Ｍ￣３￣ＧＲｈ:杨梅素杨梅素￣３￣￣３￣葡萄糖苷ꎻＱ￣３￣ＧａＲｈＧ:槲皮素￣３￣半乳糖￣鼠李糖￣葡萄糖苷ꎻＱ￣３￣ＧＲｈＧ:槲皮素￣３￣葡萄糖￣鼠李糖￣葡萄糖苷ꎻＱ￣３￣ＧａＲｈ:槲皮素￣３￣半乳糖￣鼠李糖苷ꎻＱ￣３￣ＧＲｈ:槲皮素￣３￣葡萄糖￣鼠李糖苷ꎻＱ￣３￣Ｇａ:槲皮素￣３￣半乳糖苷ꎻＱ￣３￣Ｇ:槲皮素￣３￣葡萄糖苷ꎻＫ￣３￣ＧａＲｈＧ:山柰酚￣３￣半乳糖￣鼠李糖ＧａＲｈ:￣葡萄糖苷ꎻＫ￣３￣ＧＲｈＧ:山柰酚￣３￣葡萄糖￣鼠李糖￣葡萄糖苷ꎻＫ￣３￣糖苷ꎻＫ￣３￣Ｇａ:山柰酚￣３￣山柰酚半乳糖￣３￣￣半乳糖苷鼠李糖苷ꎻＫ￣３￣Ｇ:ꎻＫ￣３￣ＧＲｈ:山柰酚山柰酚￣３￣葡萄糖苷￣３￣葡萄糖ꎮ

￣鼠李　苷　由图１还可以看出ꎬ杨梅素￣３￣葡萄糖￣鼠李糖((Ｍ￣３￣ＧＲｈ)、槲皮素￣３￣半乳糖￣鼠李糖￣葡萄糖苷(Ｑ￣３￣ＧａＲｈＧ)(Ｑ￣３￣ＧＲｈＧ)、、山柰酚槲皮素￣３￣￣３￣半乳葡萄糖糖￣￣鼠鼠李糖李糖￣￣葡葡萄糖苷萄苷Ｋ￣３￣ＧａＲｈＧ)(Ｋ￣３￣ＧＲｈＧ)和山柰酚分别对应￣３￣１葡萄糖号峰、４￣鼠李号峰糖、５￣葡糖号萄苷峰糖１０、

谱保号峰和留的１１一般号峰规ꎬ律根据它们的相对分子质量、二级质谱碎片和相关、色报道[１０ꎬ１４ꎬ１７￣１８]进行综合鉴定ꎻ其余ＦＧｓ根据标准品进行验Ｇａ、证ꎬＭ￣３￣Ｇａ、Ｍ￣３￣Ｇ、Ｑ￣３￣ＧａＲｈ、Ｑ￣３￣ＧＲｈ、Ｑ￣３￣分别对应Ｑ￣３￣Ｇ、２、３、６、７、８、９、１２、１３、１４Ｋ￣３￣ＧａＲｈ、Ｋ￣３￣ＧＲｈ、Ｋ￣３￣Ｇａ和１５号峰和Ｋ￣３￣Ｇꎮ根据色谱保留的一般规律ꎬ在反相色谱柱洗脱的过程中ꎬ按出峰时间排序依次为杨梅素糖苷(３个羟基)、槲皮素糖苷(２个羟基)、山柰酚糖苷(１个羟基)ꎬ１０号峰对应的Ｋ￣３￣ＧａＲｈＧ不符合这一规律ꎻ对于相同苷元ꎬ按出峰时间排序依次为三糖糖苷、二糖糖苷、单糖糖苷ꎬ而对于不同苷元的ＦＧｓꎬ出峰顺序为半乳糖苷类化合物、葡萄糖苷类化合物ꎮ由二级质谱碎片信息可知ꎬ杨梅素糖苷、槲皮素糖３１９、３０３苷和山柰和酚２８７ꎮ

糖苷的主要碎片离子质荷比分别为

２.２　黄酮醇糖苷标准品的质谱分析和色谱分析Ｍ￣３￣Ｇａ、Ｑ￣３￣Ｇ、Ｋ￣３￣Ｇ、为了优化ＦＧｓ的定量方法ꎬ选取Ｑ￣３￣ＧＲｈ、

反应监测(ＭＲＭ)和紫外检测器Ｋ￣３￣ＧａＲｈ(标ＰＤＡ)准品检测方法ꎬ采用多分别建立ＦＧｓ标准品峰面积与对应质量浓度梯度的标准曲线ꎬ综合比较２种检测方法的灵敏性和稳定性ꎮ

由表２可以看出ꎬ在２种检测方法下ꎬ５种ＦＧｓ０.１标准品的峰面积与对应质量浓度梯度的标准曲线在

关系~２０􀆰(Ｒ２０μｇ/ｍｌ质量浓度范围内均具有较好的线性ＭＲＭ量限(方法的检测限>０􀆰９９)ꎮ从ＬＯＱ)为０􀆰２５~(检０􀆰ＬＯＤ测７６)限μｇ为和/Ｌꎻ０􀆰定０８量限来看ꎬ利用而~ＰＤＡ０􀆰２３方法μｇ/ꎬＬꎬＬＯＤ定为１􀆰００~１􀆰５８μｇ/ＬꎬＬＯＱ为３􀆰３３~５􀆰２５μｇ/Ｌꎬ整体上高于前者１~２个数量级ꎮ由此可见ꎬＭＲＭ方法的检测灵敏度更高　复检测　将提取的同一茶叶样品在ꎮ

６次ꎬ结果发现ꎬ色谱峰的保留时间波动均小２种检测方法下各重于(０.１的精密度良好ＲＳＤ)约为ｍｉｎꎬ并０.５％ꎬ且标ꎮ

说明准品ＭＲＭ峰面方法与积的相ＰＤＡ对标方法检测准偏差准确称取６份质量为５０ｍｇ的绿茶样品ꎬ按照方法ＭＲＭ１.３.２法的５和种ＰＤＡ进行样品前处理ＦＧｓ２的种方法检测ＲＳＤ为１.３０％ꎮꎬ然后每份样品均采用如表~２􀆰３８０％ꎬＰＤＡ所示ꎬＭＲＭ方法方的５种ＦＧｓ的ＲＳＤ为２.７０％~４􀆰７０％ꎬ说明ＭＲＭ方２.３　法的重复性较茶叶中黄酮醇糖苷的定量检测

ＰＤＡ方法好ꎮ

由于质谱具有高灵敏度、方法稳定等特点ꎬ加上茶叶中的ＦＧｓ具有良好的色谱分离性能ꎬ因此本研究根据现有标准品ꎬ选择ＭＲＭ模式ꎬ利用二级质谱准确定量绿茶、红茶中的ＦＧｓꎬ优化后的ＦＧｓ质谱参数见表Ｈ]＋ꎬ子离子则为黄酮醇苷元离子４ꎬ其中母离子均采用加ꎮ氢离子峰[Ｍ＋２０８江苏农业学报　２０２１年第３７卷第１期

表２　２种检测方法下黄酮醇糖苷的标准曲线、决定系数、线性范围、检出限与定量限

Ｔａｂｌｅ２　Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅꎬｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔꎬｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅꎬｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｕｎｄｅｒｔｗｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ｍｅｔｈｏｄｓ检测方法　　　多反应监测(ＭＲＭ)

标准品Ｑ￣３￣ＧＲｈＭ￣３￣ＧａＱ￣３￣ＧＫ￣３￣Ｇ

标准曲线　　　

Ｙ１＝１.５７０３×１０４ｘ１＋６７７０

标准曲线的决定系数(Ｒ２)

０.９９８７０.９９９３０.９９９６０.９９６４０.９９９７０.９９９００.９９９４０.９９７６０.９９６１０.９９９４

线性范围(μｇ/ｍｌ)０.１~２０.００.１~２０.００.１~２０.００.１~２０.００.１~２０.００.１~２０.００.１~２０.００.１~２０.００.１~２０.００.１~２０.０

检测限(μｇ/Ｌ)０.０８０.０８０.１９０.２３０.１１１.２３１.２０１.００１.５８１.２２

定量限(μｇ/Ｌ)０.２７０.２５０.６２０.７６０.３８４.００４.００３.３３５.２５４.１０

Ｙ２＝８.２６９１×１０４ｘ２＋３７９９５Ｙ３＝５.９３７４×１０４ｘ３＋４６２３７Ｙ４＝６.２８０５×１０４ｘ４＋２７１６３Ｙ５＝４.７２８４×１０４ｘ５＋６８６８２Ｙ６＝９.８３７０×１０５ｘ６＋５８２０６８

Ｋ￣３￣ＧａＲｈ

紫外检测器(ＰＤＡ)

Ｑ￣３￣ＧＲｈＭ￣３￣ＧａＱ￣３￣ＧＫ￣３￣Ｇ

Ｙ７＝２.００００×１０６ｘ７＋１００００００Ｙ８＝１.００００×１０６ｘ８＋１００００００Ｙ９＝１.００００×１０６ｘ９＋２６５０７８Ｙ１０＝９.１６４６×１０５ｘ１０＋１００００００

Ｑ￣３￣ＧＲｈ:槲皮素￣３￣葡萄糖￣鼠李糖苷ꎻＭ￣３￣Ｇａ:杨梅素￣３￣半乳糖苷ꎻＱ￣３￣Ｇ:槲皮素￣３￣葡萄糖苷ꎻＫ￣３￣Ｇ:山柰酚￣３￣葡萄糖苷ꎻＫ￣３￣ＧａＲｈ:山柰酚￣３￣半乳糖￣鼠李糖苷ꎮＹ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５分别为多反应监测(ＭＲＭ)方法下标准品Ｑ￣３￣ＧＲｈ、Ｍ￣３￣Ｇａ、Ｑ￣３￣Ｇ、Ｋ￣３￣Ｇ、Ｋ￣３￣ＧａＲｈ的色谱峰平均积分面积ꎻｘ１、ｘ２、ｘ３、ｘ４、ｘ５分别为多反应监测(ＭＲＭ)方法下标准品Ｑ￣３￣ＧＲｈ、Ｍ￣３￣Ｇａ、Ｑ￣３￣Ｇ、Ｋ￣３￣Ｇ、Ｋ￣３￣ＧａＲｈ对应的检测质量浓度ꎻＹ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｙ９、Ｙ１０分别为ＰＤＡ检测方法下标准品Ｑ￣３￣ＧＲｈ、Ｍ￣３￣Ｇａ、Ｑ￣３￣Ｇ、Ｋ￣３￣Ｇ、Ｋ￣３￣ＧａＲｈ的色谱峰平均积分面积ꎬｘ６、ｘ７、ｘ８、ｘ９、ｘ１０分别为ＰＤＡ检测方法下标准品Ｑ￣３￣ＧＲｈ、Ｍ￣３￣Ｇａ、Ｑ￣３￣Ｇ、Ｋ￣３￣Ｇ、Ｋ￣３￣ＧａＲｈ对应的检测质量浓度ꎮ表３　２种检测方法的重复性试验(ｎ＝６)

Ｔａｂｌｅ３　Ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｓｏｆｔｗｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ(ｎ＝６)

检测方法　　多反应监测(ＭＲＭ)

黄酮醇糖苷类型Ｑ￣３￣ＧＲｈＭ￣３￣ＧａＱ￣３￣ＧＫ￣３￣Ｇ

平均峰面积５１２９２５５５０６６５１２９６８６３２２３８２９１１５９９５８４１３４９１８３０１８４７８４８３２６７６４６１３４０８３８０１７９３７９９８

相对标准偏差(％)２.８０１.３０１.５０１.６０２.６０４.７０２.７０３.７０４.６０２.７０

表４　ＭＲＭ方法下黄酮醇糖苷的质谱参数

Ｔａｂｌｅ４　Ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｕｎｄｅｒ

ｍｕｌｔｉｐｌｅｒｅａｃｔｉｏｎｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ(ＭＲＭ)ｍｅｔｈｏｄ

黄酮醇糖　苷类型　Ｍ￣３￣ＧＲｈＭ￣３￣ＧａＭ￣３￣Ｇ

母离子[Ｍ＋Ｈ]＋

６２７４８１４８１７７３７７３６１１６１１４６５４６５７５７７５７５９５５９５４４９４４９

二级质谱碎

锥孔电压

片ＭＳ/ＭＳ

(Ｖ)

(ｍ/ｚ)

３１９３１９３１９３０３３０３３０３３０３３０３３０３２８７２８７２８７２８７２８７２８７

２８２８－－－

碰撞能量(Ｖ)

３０３０－－－

电离模式正正正正正正正正正正正正正正正

Ｋ￣３￣ＧａＲｈ

Ｋ￣３￣ＧａＲｈ

紫外检测器(ＰＤＡ)

Ｑ￣３￣ＧＲｈＭ￣３￣ＧａＱ￣３￣ＧＫ￣３￣Ｇ

Ｑ￣３￣ＧａＲｈＧＱ￣３￣ＧＲｈＧＱ￣３￣ＧａＲｈＱ￣３￣ＧＲｈＱ￣３￣ＧａＱ￣３￣Ｇ

８８

１４１４８０８０－－

３０３０－－

Ｑ￣３￣ＧＲｈ:槲皮素￣３￣葡萄糖￣鼠李糖苷ꎻＭ￣３￣Ｇａ:杨梅素￣３￣半乳糖苷ꎻＱ￣３￣Ｇ:槲皮素￣３￣葡萄糖苷ꎻＫ￣３￣Ｇ:山柰酚￣３￣葡萄糖苷ꎻＫ￣３￣ＧａＲｈ:山柰酚￣３￣半乳糖￣鼠李糖苷ꎮ

Ｋ￣３￣ＧａＲｈ

Ｋ￣３￣ＧａＲｈＧＫ￣３￣ＧＲｈＧＫ￣３￣ＧａＲｈＫ￣３￣ＧＲｈＫ￣３￣ＧａＫ￣３￣Ｇ　　针对未购置标准品的ＦＧｓ进行相对定量ꎬ具体参照王智聪等[１０]的公式进行计算ꎮ选取决定系数较高的标准曲线(以Ｍ￣３￣Ｇａ为标准品)ꎬ用外标法准确定量成茶中的Ｍ￣３￣Ｇａ含量ꎬ成茶中其他ＦＧｓ的含量则根据Ｍ￣３￣Ｇａ质谱峰面积及含量确定ꎮ由于无法准确得到无标准品ＦＧｓ的质谱响应差异ꎬ因此假定ＦＧｓ与Ｍ￣３￣Ｇａ质谱响应一致ꎬ具体公式如下:

１６１６４０４０

１０１０１４１４

Ｍ￣３￣ＧＲｈ:杨梅素￣３￣葡萄糖￣鼠李糖苷ꎻＭ￣３￣Ｇａ:杨梅素￣３￣半乳糖苷ꎻＭ￣３￣Ｇ:杨梅素￣３￣葡萄糖苷ꎻＱ￣３￣ＧａＲｈＧ:槲皮素￣３￣半乳糖￣鼠李糖￣葡萄糖苷ꎻＱ￣３￣ＧＲｈＧ:槲皮素￣３￣葡萄糖￣鼠李糖￣葡萄糖苷ꎻＱ￣３￣ＧａＲｈ:槲皮素￣３￣半乳糖￣鼠李糖苷ꎻＱ￣３￣ＧＲｈ:槲皮素￣３￣葡萄糖￣鼠李糖苷ꎻＱ￣３￣Ｇａ:槲皮素￣３￣半乳糖苷ꎻＱ￣３￣Ｇ:槲皮素￣３￣葡萄糖苷ꎻＫ￣３￣ＧａＲｈＧ:山柰酚￣３￣半乳糖￣鼠李糖￣葡萄糖苷ꎻＫ￣３￣ＧＲｈＧ:山柰酚￣３￣葡萄糖￣鼠李糖￣葡萄糖苷ꎻＫ￣３￣ＧａＲｈ:山柰酚￣３￣半乳糖￣鼠李糖苷ꎻＫ￣３￣ＧＲｈ:山柰酚￣３￣葡萄糖￣鼠李糖苷ꎻＫ￣３￣Ｇａ:山柰酚￣３￣半乳糖苷ꎻＫ￣３￣Ｇ:山柰酚￣３￣葡萄糖苷ꎮ

董　方等:超高效液相色谱￣三重四级杆串联质谱法测定茶叶中黄酮醇糖苷种类及含量２０９

　　Ｃｊ＝ＡｊＭｊＣｉＤＶ/ｍＡｉＭｉ

量、Ｍ￣３￣Ｇａ含量ꎻＡｊ、Ａｉ分别表示待定量ＦＧｓ化合物的峰面积、Ｍ￣３￣Ｇａ的峰面积ꎻＭｊ、Ｍｉ分别表示待定量ＦＧｓ化合物的相对分子质量、Ｍ￣３￣Ｇａ的相对分子质量ꎻＤ表示进样前稀释倍数ꎻＶ表示提取液体积ꎻｍ表示样品质量ꎮ

如表５所示ꎬ不同ＦＧｓ组分含量在绿茶和红茶５４９２.４０ｍｇ/ｋｇꎬ而红茶中总黄酮醇糖苷含量为间存在一定差异ꎮ绿茶中总黄酮醇糖苷含量为

式中:Ｃｊ、Ｃｉ分别表示成茶茶汤中待测ＦＧｓ含

１４􀆰８０ｍｇ/ｋｇ、３５􀆰１９ｍｇ/ｋｇꎻ在红茶中ꎬＫ￣３￣ＧＲｈＧ含４２􀆰９２ｍｇ/ｋｇ、２２􀆰５９ｍｇ/ｋｇꎮ从不同苷元类型的黄Ｍ￣３￣Ｇａ、Ｍ￣３￣Ｇ)总含量为９４０􀆰１８ｍｇ/ｋｇꎬ显著高于红茶中杨梅素糖苷总含量(６７３􀆰６４ｍｇ/ｋｇ)ꎻ槲皮素Ｑ￣３￣Ｇａ、Ｑ￣３￣Ｇ)总含量在绿茶中最高ꎬ为２４３４􀆰２９

量最高ꎬ达２０２７􀆰３４ｍｇ/ｋｇꎬ而Ｑ￣３￣ＧａＲｈ、Ｋ￣３￣ＧａＲｈ、Ｋ￣３￣Ｇ的含量较低ꎬ分别为４７􀆰９１ｍｇ/ｋｇ、酮醇糖苷含量来看ꎬ绿茶中杨梅素糖苷(Ｍ￣３￣ＧＲｈ、

糖苷(Ｑ￣３￣ＧａＲｈＧ、Ｑ￣３￣ＧＲｈＧ、Ｑ￣３￣ＧａＲｈ、Ｑ￣３￣ＧＲｈ、ｍｇ/ｋｇꎬ显著高于红茶中槲皮素糖苷总含量３￣ＧＲｈＧ、Ｋ￣３￣ＧａＲｈ、Ｋ￣３￣ＧＲｈ、Ｋ￣３￣Ｇａ、Ｋ￣３￣Ｇ)总含量在红茶中占绝对优势ꎬ为３１７５􀆰２１ｍｇ/ｋｇꎬ显著高于绿茶中的山柰酚糖苷总含量(２１１７􀆰９３ｍｇ/ｋｇ)ꎮ

５９１０.１９ｍｇ/ｋｇꎬ高于绿茶中总黄酮醇糖苷含量ꎮ在１０７８.０３ｍｇ/ｋｇ、８８１􀆰０８ｍｇ/ｋｇꎬ而含量较低的是Ｑ￣３￣ＧａＲｈ、Ｋ￣３￣ＧａＲｈ、Ｋ￣３￣Ｇꎬ分别为１４􀆰６９ｍｇ/ｋｇ、

表５　黄酮醇糖苷在绿茶、红茶中的含量(ｎ＝３)

绿茶中ꎬＫ￣３￣ＧＲｈＧ、Ｑ￣３￣ＧＲｈＧ的含量较高ꎬ分别为

(２０６１􀆰３４ｍｇ/ｋｇ)ꎻ而山柰酚糖苷(Ｋ￣３￣ＧａＲｈＧ、Ｋ￣

Ｔａｂｌｅ５　Ｃｏｎｔｅｎｔｏｆｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｉｎｇｒｅｅｎｔｅａｓａｎｄｂｌａｃｋｔｅａｓ(ｎ＝３)

峰序号１２３４５６７８１０１１１２１３１４１５９

黄酮醇糖苷类型

Ｍ￣３￣ＧＲｈＭ￣３￣ＧａＭ￣３￣Ｇ

黄酮醇苷元类型杨梅素苷元杨梅素苷元杨梅素苷元槲皮素苷元槲皮素苷元槲皮素苷元槲皮素苷元槲皮素苷元槲皮素苷元山柰酚苷元山柰酚苷元山柰酚苷元山柰酚苷元山柰酚苷元山柰酚苷元

黄酮醇糖苷含量(ｍｇ/ｋｇ)绿茶１８６.４７±１.３７４８８.１７±１５.３８２６５.５４±２０.３４８６９.３３±１２.５６８８１.０８±１５.０８２３４.１２±６.２４２０５.７４±５.４１２２９.３３±１.７９１０７８.０３±２０.２４４６０.０８±１３.５２３０４.７５±１.１６３５.１９±０.８９１４.８０±０.０９２２５.０８±２.６２１４.６９±０.５０

红茶２２２.４７±６.８４１６３.８１±５.２０４６３.６１±８.２３２０９.２１±４.２１１８３.２８±５.５５５４０.９１±２.８５４２.９２±１.５７３２６.１７±１３.４４２０２７.３４±４０.３４３２７.７２±１３.３１２１３.７３±１.８５２２.５９±１.７３４７.９１±２.１３２８７.３６±１１.６２８３１.１６±１３.７７

定量方法相对定量

标准品定量标准品定量相对定量相对定量

Ｑ￣３￣ＧａＲｈＧＱ￣３￣ＧＲｈＧＱ￣３￣ＧａＲｈＱ￣３￣ＧＲｈＱ￣３￣ＧａＱ￣３￣Ｇ

标准品定量标准品定量标准品定量标准品定量相对定量相对定量

Ｋ￣３￣ＧａＲｈＧＫ￣３￣ＧＲｈＧＫ￣３￣ＧａＲｈＫ￣３￣ＧＲｈＫ￣３￣ＧａＫ￣３￣Ｇ

标准品定量标准品定量标准品定量标准品定量

峰序号与图１相同ꎮＭ￣３￣ＧＲｈ:杨梅素￣３￣葡萄糖￣鼠李糖苷ꎻＭ￣３￣Ｇａ:杨梅素￣３￣半乳糖苷ꎻＭ￣３￣Ｇ:杨梅素￣３￣葡萄糖苷ꎻＱ￣３￣ＧａＲｈＧ:槲皮素￣３￣半乳糖￣鼠李糖￣葡萄糖苷ꎻＱ￣３￣ＧＲｈＧ:槲皮素￣３￣葡萄糖￣鼠李糖￣葡萄糖苷ꎻＱ￣３￣ＧａＲｈ:槲皮素￣３￣半乳糖￣鼠李糖苷ꎻＱ￣３￣ＧＲｈ:槲皮素￣３￣葡萄糖￣鼠李糖苷ꎻＱ￣３￣Ｇａ:槲皮素￣３￣半乳糖苷ꎻＱ￣３￣Ｇ:槲皮素￣３￣葡萄糖苷ꎻＫ￣３￣ＧａＲｈＧ:山柰酚￣３￣半乳糖￣鼠李糖￣葡萄糖苷ꎻＫ￣３￣ＧＲｈＧ:山柰酚￣３￣葡萄糖￣鼠李糖￣葡萄糖苷ꎻＫ￣３￣ＧａＲｈ:山柰酚￣３￣半乳糖￣鼠李糖苷ꎻＫ￣３￣ＧＲｈ:山柰酚￣３￣葡萄糖￣鼠李糖苷ꎻＫ￣３￣Ｇａ:山柰酚￣３￣半乳糖苷ꎻＫ￣３￣Ｇ:山柰酚￣３￣葡萄糖苷ꎮ

　　本研究利用质谱ＭＲＭ检测法ꎬ基于１０种标准品对茶叶ＦＧｓ检测的质谱条件进行了优化ꎬ在成品茶(绿茶、红茶)中鉴定出１５种ＦＧｓꎬ包括３种杨梅素糖苷、６种槲皮素糖苷和６种山柰酚糖苷ꎮ此外ꎬ本研究对已有标准品的ＦＧｓ进行了绝对定量ꎬ其余

５种基于王智聪等[１０]的方法进行相对定量分析ꎮ与现有主流方法[３ꎬ１０](表６)相比ꎬ优化后的质谱条件使ＦＧｓ化合物的检测时间缩短了３０％ꎬ并且组分的分离度更强ꎮＷｕ等[３]利用负离子检测模式比较了ＵＰＬＣ￣ＱｑＱ￣ＭＳ/ＭＳ与ＨＰＬＣ￣ＭＳ的差异ꎬ结果表

２１０江苏农业学报　２０２１年第３７卷第１期

明ꎬＵＰＬＣ￣ＱｑＱ￣ＭＳ/ＭＳ法的检测灵敏度高于ＨＰＬＣ￣相同仪器设备条件下由二级质谱(ＭＲＭ检测方法)

ＭＳ法ꎮ而本研究采用正离子模式ꎬ进一步证实了在建立的ＦＧｓ检测方法的检出限整体上低于ＰＤＡ方法１~２个数量级ꎬ灵敏度更高ꎮ与Ｗｕ等[３]的方法

表６　茶叶中黄酮醇糖苷检测方法的比较

Ｔａｂｌｅ６　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｉｎｔｅａ

检测方法　　ＨＰＬＣ￣ＵＶ￣ＭＳ(ａ)

浸提方式蒸馏水

电离模式[Ｍ＋Ｈ]＋[Ｍ＋Ｈ]－[Ｍ＋Ｈ]－

ｎｓ[Ｍ＋Ｈ]＋

ｎｓｎｓ[Ｍ￣Ｈ]－

ｎｓ[Ｍ￣Ｈ]－

相比ꎬ用正离子模式ＭＲＭ方法检测的ＦＧｓ质谱峰响应强度更高ꎬ能够有效降低样品机制效应(即干扰组分对目标组分电离的影响)对分析的干扰程度ꎬ有利于低质量浓度ＦＧｓ的定量分析ꎮ

黄酮醇苷数量

(个)

２、５、４、０５、５、５、０５、５、５、０３、４、３、２３、６、６、０４、７、７、０４、７、７、０４、７、７、０２、４、３、０５、５、０、０５、５、５、０

ＵＰＬＣ￣ＱｑＱ￣ＭＳ/ＭＳ(ｂ)９９％(体积分数)

甲醇(含体积分数为１􀆰０％的甲酸)ＨＰＬＣ￣ＴＯＦ￣ＭＳ(ｂ)ＵＰＬＣ￣ＰＤＡ(ｃ)

９９％(体积分数)

甲醇(含体积分数为１􀆰０％的甲酸)ＤＭＳＯ(二甲基亚砜)＋５０％(体积分数)甲醇

３４.３５~４６.５１１０.２５~１４.５４１２.２５~３９.４５４.００~２２.００１２.００~１８.５０５.００~１５.００３０.００~６０.００３０.００~６０.００３７.８６~４６.１３２６.００~４０.００３.６０~７.４０

保留时间(ｍｉｎ)

线性范围

ｎｓ

定量限(ＬＯＱ)６.０×１０－３~３.６×１０－２μｍｏｌ/Ｌ２.９０~７.６８μｍｏｌ/Ｌ０.６４~０.９４ｍｇ/ｋｇ

ｎｓｎｓ

检测限(ＬＯＤ)１.０×１０－３~１.１×１０－２μｍｏｌ/Ｌ０.９０~２.４３μｍｏｌ/Ｌ０.２１~０.３２ｍｇ/ｋｇ

ｎｓｎｓ

０.３６~２５.００μｍｏｌ/Ｌ１.６０~５０.００μｍｏｌ/Ｌ０.８８~１４.００ｍｇ/ｋｇ

ｎｓ

ＵＰＬＣ￣ＰＤＡ￣ＭＳ/ＭＳ(ｄ)８０％(体积分数)甲醇

水溶液ＵＰＬＣ￣ＰＤＡ(ｅ)ＨＰＬＣ￣ＰＤＡ(ｅ)ＨＰＬＣ￣ＥＳＩ￣ＭＳｎ(ｅ)ＨＰＬＣ￣ＵＶ(ｆ)ＨＰＬＣ￣ＰＤＡ￣ＭＳｎ(ｇ)

７０％(体积分数)甲醇水溶液

７０％(体积分数)甲醇水溶液

７０％(体积分数)甲醇水溶液

高温(７０~１００℃)纯净水

纯净沸水(１００℃)

０.０５~１０.９７ｍｇ/Ｌ０.０５~１０.９７ｍｇ/Ｌ０.０５~１０.９７ｍｇ/Ｌ

ｎｓｎｓ

０.５２~０.９９ｍｇ/Ｌ０.５２~０.９９ｍｇ/Ｌ

ｎｓｎｓｎｓ

０.２０ｍｇ/Ｌ０.２０ｍｇ/Ｌ

ｎｓｎｓｎｓ

ＵＰＬＣ￣ＱｑＱ￣ＭＳ/ＭＳ(ｈ)７５％(体积分数)甲醇

水溶液

[Ｍ＋Ｈ]＋

０.１~２０.０μｇ/ｍｌ０.２５~０.７６μｇ/Ｌ０.０８~０.２３μｇ/Ｌ(ＭＲＭ)(ＭＲＭ)(ＭＲＭ)０.１~２０.０μｇ/ｍｌ３.３３~５.２５μｇ/Ｌ１.００~１.５８μｇ/Ｌ(ＰＤＡ)(ＰＤＡ)(ＰＤＡ)

ＨＰＬＣ:高效液相色谱ꎻＵＶ:紫外ꎻＭＳ:质谱ꎻＵＰＬＣ:超高效液相色谱ꎻＱｑＱ:三重串联四极杆质谱ꎻＰＤＡ:二极管阵列ꎻＥＳＩ:电喷雾电离源ꎮ检测方

法后标注ａ表示采用的检测材料为绿茶、白茶、乌龙茶的一芽三叶鲜样[１９]ꎻ检测方法后标注ｂ表示采用的检测材料为野茶树芽、第２叶、第４叶、茎、根冷冻鲜样[３]ꎻ检测方法后标注ｃ表示采用的检测材料为红茶[１３]ꎻ检测方法后标注ｄ表示采用的检测材料为绿茶和红茶[１０]ꎻ检测方法后标注ｅ表示采用的检测材料为绿茶、乌龙茶和红茶[１４]ꎻ检测方法后标注ｆ表示采用的检测材料为龙井茶[２]ꎻ检测方法后标注ｇ表示采用的检测材料为印尼绿茶和红茶[２０]ꎻ检测方法后标注ｈ表示采用的检测材料为龙井和滇红(本研究)ꎮ黄酮醇苷数对应的数字分别表示检测到的杨梅素糖苷种类数量、槲皮素糖苷种类数量、山柰酚糖苷种类数量、异鼠李素糖苷种类数量ꎮＭＳｎ表示串联质谱ꎮｎｓ表示空白ꎮ

３　讨论

线性关系良好ꎬ其定量限为０.２５~０􀆰７６μｇ/Ｌꎬ检测限为０.０８~０􀆰２３μｇ/Ｌꎬ以上参数均优于ＰＤＡ检测方法ꎮ同时ꎬ本研究利用目标化合物的二级质谱碎片进行定量ꎬ可以选择性地检测被定量化合物ꎬ使同分异构体(如Ｍ￣３￣Ｇａ/Ｍ￣３￣Ｇ、Ｑ￣３￣ＧａＲｈ/Ｑ￣３￣ＧＲｈ)得到较好分离ꎮ此外ꎬ根据精密度试验和重复性试验的相对标准偏差ꎬＭＲＭ检测方法的稳定性优于ＰＤＡ检测方法ꎮ由此可见ꎬ基于二级质谱ＭＲＭ模式建立的茶叶中ＦＧｓ的ＭＲＭ检测方法灵敏度和分离度高、稳定性好ꎮ然而ꎬ当不需要较高

３.１　ＭＲＭ检测方法的优势

ＧＲｈ、Ｍ￣３￣Ｇａ、Ｑ￣３￣Ｇ、Ｋ￣３￣Ｇ、Ｋ￣３￣ＧａＲｈ)ꎬ分别同时采用ＭＲＭ检测方法和ＰＤＡ检测方法ꎬ基于方法的灵敏度和稳定性指标分析比较了二者对于茶叶中ＦＧｓ的定性、定量效果ꎮ结果显示ꎬ在ＭＲＭ方法下ꎬ成茶中１５种ＦＧｓ被定量测定ꎬ并且ＦＧｓ的基质标准曲线在０.１~２０􀆰０μｇ/ｍｌ质量浓度范围内

本研究选取５种黄酮醇糖苷标准品(Ｑ￣３￣

董　方等:超高效液相色谱￣三重四级杆串联质谱法测定茶叶中黄酮醇糖苷种类及含量２１１

的灵敏度和特异的分离度时ꎬＰＤＡ检测方法可以作为ＭＲＭ检测的１种快速且经济的替代方法ꎬ茶叶中主要ＦＧｓ化合物的色谱峰根据其保留时间能３.２　够轻松地得到鉴定ＭＳ(ＭＲＭ)检测条件的优化

ꎬ并通过积分进行定量分析[２１]ꎮ

样品前处理对于样品鉴定和结果的准确性有

至关重要的影响[２２]的提取方法ꎬ利用热水法和有机溶剂法均能提取黄ꎮ溶剂法是黄酮类化合物常用酮醇苷类物质ꎮ陈丛瑾等[２３]研究发现ꎬ黄酮苷类物质易溶于水以及甲醇、乙醇等强极性溶剂ꎬ高浓度的醇易于提取苷元ꎬ而用６０％(体积分数)乙醇或甲醇能有效提取含苷类的黄酮类化合物ꎮ尽管沸水也能够提高黄酮苷类物质提取率ꎬ但易将蛋白质、糖类等化合物溶于水中ꎬ从而降低了黄酮醇苷的浸出率ꎮ因此ꎬ本研究以７５％(体积分数)甲醇作为提取剂ꎬ结果显示ꎬ色谱峰分离效果优于其他试验结果[２￣３ꎬ１３ꎬ２０￣２１]通常由物质本身的性质ꎮ超高效液相色谱、固定相(ＵＰＬＣ)(色谱柱填料的出峰时间、柱长短、粒径)、流动相、柱温和流速等因素共同决定ꎮ本研究采用Ｔ３色谱柱ꎬ与Ｋｉｍ等[１３￣１４]采用的Ｃ谱柱相比ꎬＴ３色谱柱对极性较强的ＦＧｓ类化合物的１８色保留效果好ꎮＫｉｍ等[１３]选用含有１􀆰０％(体积分数)甲酸的１５％(体积分数)乙腈作为流动相进行等度９９􀆰洗脱ꎬ本研究使用含有０􀆰１％(体积分数)甲酸的

并且在分离时间９％(体积分数、)峰型方面的优势明显乙腈作为流动相ꎬ进行梯度洗脱ꎬ能够保证短ꎬ时间内将样品中的强保留组分洗脱ꎮ此外ꎬ在本研究中柱温设为Ｋｉｍ等４０℃ꎬ流速设为０􀆰４ｍｌ/ｍｉｎꎬ相较于[１３￣１４]的方法ꎬ在温度、流速上均提高了５０％ꎬ

由此说明ꎬ在相同仪器条件下ꎬ适当提高柱温、流速３.３　有利于缩短黄酮醇糖苷在成茶中的积累与分布ＦＧｓ的分离时间ꎬ提高分离度ꎮ

不同茶树品种、产地的生长环境和加工工艺造成了茶叶品质成分的差异ꎮ有研究发现ꎬＵＶ￣Ｂ辐射的增强、温度的升高均能够提升植物体的ＦＧｓ含量[２４￣２５]纬度低、ꎮ海拔高本研究发现ꎬ紫外线强度相对较高ꎬ与浙江茶区相比ꎬ加上较高的ꎬ云南茶区环境温度会诱导茶树体内的碳代谢ꎬ从而促进多酚类物质(ＦＧｓ、儿茶素等)的积累ꎻ相反ꎬ在浙江茶区ꎬ纬度高ꎬ海拔低ꎬ春季温度相对较低ꎬ有利于加速茶树体内的氮代谢ꎬ促进茶树体内氨基酸的合成ꎬ而茶树类黄酮物质的合成相对受到抑制

[２６￣２７]

ꎮＦＧｓ对于

茶汤的苦味、涩味具有增强作用ꎬ一般认为酚氨比值低的茶鲜爽味高ꎬ适制绿茶ꎬ而酚氨比值高的茶苦味和涩味较高ꎬ适合加工成红茶[１８]茶区的茶叶更有利于加工成红茶、ꎮ黑茶等发酵茶由此可见ꎬ云南ꎬ而浙江茶区的环境条件为绿茶的加工提供了品质保证ꎮ

从品种的适制性来看ꎬ不同叶型茶树品种的适制性也有差异ꎮ研究发现ꎬ与小叶种茶树相比ꎬ大叶种茶树的多酚类物质含量高１０％以上ꎬ因此更适合加工成红茶ꎬ而小叶种茶树的氨基酸含量高ꎬ适合制成绿茶[２８]ꎮꎬ戴伟东等[１８]对ＦＧｓ与茶树品种适制性的研究发现黄酮醇半乳糖苷化代谢旺盛的茶树品种适制绿茶ꎬ而黄酮醇葡萄糖苷化代谢旺盛的茶树品种适制红茶ꎮＦＧｓ组分中的Ｋ￣３￣Ｇ/Ｋ￣３￣Ｇａ组分被认为与茶汤涩味高度相关ꎬ其含量的积累变化规律对茶叶的适制性起到了指示作用ꎮ而在本研究中(Ｋ￣３￣Ｇꎬ成品红茶中的Ｋ￣３￣Ｇ含量及其葡萄糖苷化程度茶叶在发酵过程中可能降低了与Ｋ￣３￣Ｇａ的比值)均小于绿茶成品茶Ｋ￣３￣Ｇ含量ꎬ从而使ꎬ推测红茶的涩味降低ꎮ

陈宗懋等[２９]的统计结果显示ꎬ红茶中的总ＦＧｓ含量要高于绿茶ｓｏｎ等ꎬ这与本研究结果一致ꎮ但Ｐｅｔｅｒ￣[３０]的研究结果与之相反ꎬ即在绿茶、乌龙茶中ꎬ总ＦＧｓ含量则高于红茶ꎮＪｉａｎｇ等[１４]通过ＵＰＬＣ方法ꎬ在３类成品茶检测到１８种ＦＧｓꎬ发现绿茶中的山柰酚糖苷组分含量最高ꎬ而红茶中的槲皮素糖苷含量占绝对优势ꎮ本研究结果则与之相反ꎬ即在绿茶中以槲皮素糖苷为主ꎬ而在红茶中则以山柰酚糖苷为主ꎮ由此可见ꎬ茶叶中的ＦＧｓ含量可能受多种因素影响而呈动态变化ꎬ对不同茶类ＦＧｓ的积累与分布规律仍需深入研究ꎮ参考文献:

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