第３２卷第２期 浙江师范大学学报（自然科学版） Ｖｏ１．３２，Ｎｏ．２ ２００９年６月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．） Ｊｕｎ．２００９ 文章编号：１００１－５０５ ｌ（２００９ １ ０２－０２０７－０５ 松针总黄酮的提取工艺优化研究 徐丽珊， 张萍华， 张瑜 （浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华３２１００４） 摘要：研究了松针中总黄酮的提取工艺．通过比较３种松针水提液和醇提液的总黄酮含量，筛选出水提法作 为工艺优化的提取方法，湿地松松针中总黄酮含量最高．通过单因素实验和正交实验，确定了各因素影响松针 总黄酮提取的主次顺序为：提取温度＞酸碱度＞料液比＞提取时间，并得到了最佳提取工艺条件：提取温度为 １００ ｏＣ，提取时间为３ ｈ，酸碱度为ｐＨ １０．０，料液比为１：１４．最佳工艺条件下湿地松松针总黄酮的得率为 （５．４７４ ３±０．０１３ １）％． 关键词：湿地松；松针；总黄酮；提取工艺；正交实验 中图分类号：０６５７．３２ 文献标识码：Ａ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｆａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ｐｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅｓ ＸＵ Ｌｉｓｈａｎ， ＺＨＡＮＧ Ｐｉｎｇｈｕａ， ＺＨＡＮＧ Ｙｕ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， 口ｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｈｕａ Ｚｈｅｉｆａｎｇ ３２１００４。Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ｐｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅｓ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｏｍ— ｐａｒｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅｓ ｏｆ Ｐ ｅｌｌｉｏｔｔｉｉ Ｅｎｇｅｌｍ．ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ．Ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏ￣ｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｔｈｅ ｐｒｉ— ｍａｒｙ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｏｒｄｅｒ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｐｉｎｕｓ ｅｌ— ｌｉｏｔｔｉｉ Ｅｎｇｅｌｍ．ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ：ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ＞ｐＨ＞ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ＞ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐｒｏｃｅｓｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｗａｓ（５．４７４ ３±０．０１３ １）％ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｈｅｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ １００℃。ｐＨ＝１０．０，ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｗａｓ １：１４，ｅｘ－ ｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ ３ ｈ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｔｉｉ Ｅｎｇｅｌｍ．；ｐｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅｓ；ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｏ￣ｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ 松针（ｐｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅｓ）是松科（Ｐｉｎａｃｅａｅ）松属 草纲目》记载：“松针，气味苦、温、无毒，久服令人 （Ｐｉｎｕｓ）植物的针状叶，别名猪鬃松叶、松毛、山松 不老，轻身益气，主治风湿疮，生毛发，安五脏，守 须、松叶．我国有丰富的松针资源，而且品种多，分 中，不饥延年”．现代研究表明，松针具有镇痛、抗 布既广又相对比较集中．松针用药历史悠久，《本 炎、镇咳、祛痰、抗突变、降血脂、降血压、抑菌等作 收文日期：２００８－０６－１９；修订日期：２００８—１０－２７ 基金项目：浙江省科技计划项目（２００７Ｃ３２０３９）；浙江省教育厅科研项目（２００６０４９０） 作者简介：徐丽珊（１９６６一），女，浙江金华人，副教授，硕士．研究方向：生理生化；食品营养 ２０８ 浙江师范大学学报（自然科学版） ２００９正 用 引，其利用价值日益受到重视．已有报道，松针 含有蛋白质、维生素、黄酮等多种活性成分 引，松 针黄酮有抗肿瘤和抗氧化等多种生理作用Ｅ６－ｓ１．但 目前对松针中黄酮类化合物提取工艺优化的报道 不多，特别是对不同种类松针中黄酮含量的比较 更少．笔者对浙江省分布面积较多的马尾松、湿地 松和黑松３种松针进行了比较，筛选了总黄酮含 通过单因素实验结果分析，选择提取温度、提 取时间、料液比和酸碱度４个因素，设计了４因素 ３水平正交实验，所采用的正交表为Ｌ。（３ ），以浸 提液中的黄酮得率作为实验结果，确定湿地松中 黄酮的最佳提取条件． １．２．６最佳提取工艺实验 通过对正交设计实验的结果进行极差分析和 方差分析，获得最优化的工艺组合，并在此最优化 的条件下进行湿地松松针水提液的制备，测定湿 地松松针总黄酮的得率． １．３统计学处理 量最高的松针种类，探讨了该种松针中黄酮类化 合物的最佳提取工艺，为进一步开发和利用浙江 省的松针资源提供理论依据． １材料和方法 １．１实验材料和仪器 马尾松（Ｐｉｎｕｓ ｍａｓｓｏｎｉａｎａ Ｌａｍｂ．）、黑松（Ｐ — ｎ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ Ｐａｒ１．）和湿地松（Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｔｉｉ Ｅｎ— 采用Ｅｘｃｅｌ ２００３进行回归和相关分析，用 ＳＰＳＳ １３．０统计软件进行方差分析． ２结果与分析 ２．１芦丁标准工作曲线及其标准曲线方程 ｇｅｌｍ．）的松针，均采自浙江师范大学校园内的挂 牌植物．采摘３种松针，清洗干净，于室温中过夜 芦丁标准工作曲线及其标准曲线方程式见 图１． 自然晾干，备用． 芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）． ＲＥ－５２ ＡＡＢ旋转蒸发器，７５２型紫外可见分 光光度计，ＳＨＢ．ＵＩ循环水式多用真空泵，ｐＨＳ．２Ｃ 精密ｐＨ计，ＨＨ－Ｓ恒温水浴锅等． １．２实验方法 １．２．１标准曲线的绘制 鲁 ｝Ⅱ、 参考２００５年版中华人民共和国药典方法 ｊ： 铝．亚钠比色法． １．２．２松针水提液的制备 图１ 芦丁标准工作曲线 称取新鲜松针，剪成１—２ ｃｍ长，置于圆底烧 瓶中，按料液比１：１２加蒸馏水，加热煮沸回流 浸提２．５ ｈ后，减压过滤，旋转蒸发浓缩，测定松 针总黄酮含量，计算总黄酮得率． １．２．３松针醇提液的制备 ２．２冬季和春季３种松针水提和醇提总黄酮得 率的比较 口冬季 一春季 取新鲜松针，剪成１～２ ｃｍ长，置于索氏提取 器中，按料液比１：１２加９５％乙醇液，置于恒温 磺 水浴锅中，８５℃下恒温水浴回流浸提２．５ ｈ，经减 压过滤后旋转蒸发浓缩，测定松针总黄酮含量，计 算总黄酮得率． １．２．４单因素实验 本实验对湿地松松针总黄酮的提取进行工艺 优化，主要选用提取温度、提取时间、料液比、酸碱 蕊 枢 ： ＿． ． ． Ｉ． 椭嬲棚 脚ＩＩｊＩ蹦嘲瑚献 胜 松针提取液 图２ 冬季和春季３种松针总黄酮得率的比较 从图２可以看出，无论是冬季还是春季、水提 度和提取次数作为考察因素． １．２．５正交设计实验 或是醇提，湿地松松针的黄酮得率均显著高于其 第２期 徐丽珊，等：松针总黄酮的提取工艺优化研究 ２０９ 他２种松针的黄酮得率；无论是冬季还是春季，湿 地松松针水提的黄酮得率均显著高于醇提的黄酮 得率；不管是水提还是醇提，３种松针冬季黄酮得 率均显著高于春季黄酮得率，并且春冬两季间湿 地松松针黄酮得率的差值是最大的．因此，以下实 （３）酸碱度的影响 料液比１：１２，提取时间２．５ ｈ，提取温度 １００ ｏＣ，提取１次，不同酸碱度（ｐＨ＝４．０，６．０，８．０ 和１０．０）的条件下，测得的黄酮得率见图５． 验都以湿地松松针为原料，以水为提取溶剂． ２．３湿地松松针总黄酮提取工艺条件的确定 ２．３．１ 单因素实验 （１）提取温度的影响 料液比为１：１２，提取时间为２．５ ｈ，ｐＨ＝７， 提取１次，在不同提取温度（７０，８０，９０和１００℃） 条件下提取松针总黄酮，测得的黄酮得率见图３． ７０ ８０ ９０ １００ ｔ／℃ 图３提取温度对松针总黄酮浸提效果的影响 从图３可以看出，随着提取温度的升高，松针 总黄酮得率也随之增加．其原因是随着提取温度 的升高，溶剂的粘度减小，分子运动速度加快，浸 提液的扩散系数增加，促使浸提速度加快． （２）提取时间的影响 提取温度为１００ ｏＣ，料液比为１：１２，ｐＨ＝７， 提取１次，不同提取时间（１．５，２．０，２．５和３．０ ｈ） 条件下提取松针总黄酮，测得的黄酮得率见图４． 图４提取时间对松针总黄酮浸提效果的影响 从图４可以看出，随着提取时间的增加，黄酮 得率总的呈上升趋势．在提取时间为２．０ ｈ时基 本上达到最高，之后趋于平缓． ５ ２ 瓣４８ 啦 暖 槛４４ ４．０ ４．０ ６０ ８．０ ｌ０．０ ｐＨ 图５ ｐＨ对松针总黄酮浸提效果的影响 逞褂 驻牧 ∞ ６ １ ∞ ２ １ ∞ ８ Ｏ ∞ Ｏ ∞ ０ 从图５可以看出，在给定条件下，随着ｐＨ值 的增大，松针总黄酮的得率也随之增加，且在ｐＨ １０．０时达到最高． （４）料液比的影响 提取温度１００ ｏＣ，提取时间２．５ ｈ，ｐＨ＝７，提 取１次，不同料液比（１：８，１：１０，１：１２和 １：１４）条件下，测得的黄酮得率见图６． １：８ １：ｌ０ １：１２ ｌ：１４ 料液比 图６料液比对松针总黄酮浸提效果的影响 从图６可以看出，在给定的条件下，随着料液 比的增大，松针总黄酮得率总的呈上升趋势． （５）提取次数的影响 ｐＨ＝７，提取温度１００ ｏＣ，提取时间２．５ ｈ，料 液比１－１２，不同提取次数（１，２和３次）条件下， 测得的松针黄酮得率见图７． 多次提取有利于植物体中天然产物的浸出． 从图７可以看出，在给定的条件下，随着提取次数 的增加，松针总黄酮得率也随之增加．但考虑到去 除水分的成本较高和时间的，在正交设计实 验和最佳工艺条件验证实验中均采用提取１次． ２１０ 惜难鼹板 浙江师范大学学报（自然科学版） ２００９正 瑚 瑚 瑚 枷 啪 通过对单因素实验结果的综合分析，选择提 取温度、提取时间、料液比和酸碱度４个因素，各 取３个水平，以松针总黄酮得率为实验指标，进行 Ｌ。（３ ）正交实验，正交实验因素与水平见表１，正 交实验结果及分析见表２和表３． 表１ 正交实验因素水平表 提取次数 图７提取次数对松针总黄酮浸提效果的影响 ２．３．２正交设计实验 表２正交实验结果及数据分析 注：肼为因素水平和，ｍ为平均因素水平 表３正交实验方差分析 组合为Ａ Ｂ。ｃ，Ｄ，，即最佳工艺条件为：提取温度 为１００ ｑＣ，酸碱度为ｐＨ＝１０．０，提取时间为３ ｈ， 料液比为１：１４． ２．３．３ 最佳提取工艺验证实验 按Ａ Ｂ，ｃ Ｄ 实验组合，即在提取温度为 １００ ｏＣ，酸碱度为ｐＨ＝１０．０，提取时间为３ ｈ，料 注：Ｆｏ∞（２，１８）＝３．５５，ｒｏ【１１（２，１８）＝６．０１； 女表不有极 液比为１：１４的条件下进行３次平行实验，结果 显著性差异， 表示有显著性差异． 表明所选组合为最佳优化工艺条件，测得的湿地 从表２和表３可知，４种因素对湿地松总黄 松总黄酮得率见表４．由表４可知：Ａ Ｂ，Ｃ，Ｄ，条件 酮提取的影响程度顺序为提取温度＞料液比＞酸 下，黄酮得率确实高于表２中的每一项实验结果， 碱度＞提取时间，提取温度对提取效果影响最大， Ａ Ｂ ｃ Ｄ 为最佳工艺优化组合． 提取时间的影响最小，４种因素的影响都是极显 著的．因此，在进行松针总黄酮提取时，要对提取 ３结论 温度加以严格控制，同时也要考虑到酸碱度和固、 （１）确定了以芦丁标准品为对照品的可见分 液相工艺物料的比例．由表２可确定，最佳的实验 光光度法测定总黄酮含量的方法，其检测波长为 第２期 徐丽珊，等：松针总黄酮的提取工艺优化研究 ２ｌ １ 表４优化提取工艺验证实验结果 ５１０ ｎ．ｍ，回归方程为：ｐＢ＝０．１０４Ａ５ｌｏ＋０．０００ １，相 的提取方法，操作简单易行，经济有效．此外，水提 关系数Ｒ ＝０．９９８ ８．该方法操作简便、重现性好． 法不仅提取出了黄酮类成分，其他可溶性的成分 （２）通过提取溶剂的选择实验，确定以水为 如氨基酸、蛋白质、多糖等也会进入水中，因此，用 溶剂较适合松针中黄酮类化合物的提取．在马尾 此提取液开发饮料，极具保健功效． 松、湿地松和黑松３种松针中，湿地松松针的总黄 在浙江省分布面积较多的马尾松、湿地松和 酮含量最高． 黑松３种松针提取液中，湿地松松针的黄酮含量 （３）通过单因素实验和正交实验，结合极差 显著高于其他２种．我国从２Ｏ世纪７Ｏ年代中后 分析和方差分析，可以知道各因素影响顺序为提 期到２０世纪９０年代中后期，在许多地方种植了 取温度＞料液比＞酸碱度＞提取时间，确定了湿 大面积的湿地松，形成了多个人工湿地松林 地松松针中黄酮类化合物的最佳提取工艺条件 区¨ ，这种既广泛又相对较集中的分布极有利于 （提取温度为１００ ｏＣ，提取时间为３ ｈ，酸碱度为 松针的加工利用． ｐＨ＝１０．０，料液比为１：１４）．在最佳工艺条件 另外，通过比较冬、春２个季节的黄酮得率， 下，所测得的湿地松松针总黄酮得率为 表明冬季松针黄酮得率高于春季得率，其原因是 （５．４７４ ３±０．０１３ １）％，相对标准偏差为 黄酮类化合物是一类具有多种生物及药理活性的 ０．２３９ １％． 植物次生代谢产物，其合成过程可能受到光照、温 ４讨论 度、水分、矿物质等环境因素的影响；或冬季恶劣 的环境条件可能诱导黄酮类化合物的合成，从而 本文结果表明水提法优于醇提法，说明松针 导致了黄酮类物质的积累． 中的黄酮类化合物主要以水溶性黄酮类化合物的 由于时间的，本课题主要研究了松针黄 形式存在．其原因是黄酮类化合物是一类极性较 酮类化合物的最佳提取工艺，没有对提取所得的 强的化合物，而水又是典型的强极性溶剂，对植物 黄酮类物质进行分离纯化鉴定，有待今后进一步 组织的穿透能力强，其水提法提取效率固然比醇 探讨和研究． 提法的高．因此，本实验选用水提法作为工艺优化 参考文献： ［１］李萍，刘友平．松针的研究进展［Ｊ］．成都中医药大学学报，２００１，２４（１）：４９－５０． ［２］Ｌｉｍ Ｙ Ｓ，Ｓｈｉｎ Ｄ Ｈ．Ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂａｃｔｅｉｒａｌ ｅｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅ（Ｐｉｎｕｓ ｄｅｎｓｉ￣ｏｒａ Ｓ．ａｎｄ Ｚ．）ｅｘｔｒａｃｔｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００５，２２（１）：３７＿４５． ［３］ＬｉｍＹ Ｓ，ＰａｒｋＫＮ，ＢａｅＭ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉｍｉｃｍｂｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｎｗ如 ｏｒａ Ｓｉｅｂ ａｎｄ Ｚｕｃｃ ｏｎｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｉｒａ［Ｊ］．ＪＫｏｒｅ－ ａｎ Ｓｏｃ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｎｕｔｒ，２００１，３０（６）：１１５８—１１６３． ［４］毕跃峰，郑晓珂，冯卫生，等．松针的研究进展及开发利用［Ｊ］．河南中医药学刊，１９９９（２）：１４—１７． ［５］Ｃｅｖｄｅｔ Ｎｅｒｇｉｚ，ｆｃｌａｌ Ｄｔ￣ｎｍｅｚ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｔｉｒｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ ｏｆＰ／ｎｕｚ ｐｉｎｅａ Ｌ．ｓｅｅｄｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉ￣ｒｙ，２００４，８６（３）：３６５￣６８． ［６］张培刚，郑鸿雁，昌友权，等．松针黄酮的体外抗氧化作用研究［Ｊ］．食品科学，２００５，２６（９）：５０６３０８． ［７］彭欣莉，郑鸿雁，昌友权．松针黄酮抗氧化和降血脂作用研究［Ｊ］．食品工业科技，２００５，２６（１２）：１７５－１７６． ［８］苏薇薇，张冰若，劳业兴．松针化学成分及药理研究进展［Ｊ］．中药材，２００３，２６（９）：６８１－６８３． ［９］国家药典委员会．中华人民共和国药典：第一部［Ｍ］．２００５年版．北京：化学工业出版社，２００５：２４６－２４７． ［１Ｏ］刘晓庚，陈梅梅．我国松针的开发利用研究及进展［Ｊ］．林产化工通讯，２００３，３７（４）：２９－３４． （责任编辑薛荣）
