耐酸性_淀粉酶高产菌株的选育

耐酸性α2淀粉酶高产菌株的选育

李　勃,卫拯友,党　永

(陕西省微生物研究所,陕西西安　710043)

摘　要　从酒曲中筛选得到1株高产耐酸性α2淀粉酶的野生菌株Tx278,经鉴定为曲霉属的黑曲霉(Aspergil2

lusniger)。以Tx278作为出发菌株,通过紫外线(UV)诱变和亚硝基胍(NG)诱变,获得了遗传稳定的高产菌株UN78358,其产酶量可达到1120U/mL。关键词　耐酸性α2淀粉酶;黑曲霉;紫外线(UV)诱变;亚硝基胍(NG)诱变中图分类号　Q93　　　文献标识码　A　　　文章编号　1005-7021(2007)04-0046-04

BreedingofAcid2resistantα2amylaseProducingStrains

LIBo,WEIZheng2you,DANGYong

(ShaanxiMicrobiologyInstituteXi,an710043)

Abstract　Anacid2stableα2amylaseproducingstrainTx278wasscreenedfromdistiller’syeast.ItwasidentifiedasAspergillusnigerbelongingtoAspergillusmicheli.Tx278wasusedasstartupstraintoproduceUN78358strainofhigher

zymogenouscapabilitybyUVmutationandNGmutation.Themutanthaveastronggeneticstabilityanditsproductivi2tycanreachto1120U/mL.

Keywords　acid2resistantα2amylase;Aspergillusniger;UVmutagenesis;NGmutagenesis

α2　　淀粉酶广泛存在于动物、植物和微生物中,

是目前最常见的工业用酶之一,被广泛应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织以及医药等行业。由于它能作用于淀粉分子内部的α21,4糖苷键,很容易将长链淀粉水解成短链的糊精,从而使黏稠的淀粉糊很快失去黏性而液化,碘的呈色反应很快消失,故又称为淀粉液化酶。由于普通α2淀粉酶和糖化酶作用pH有差异(前者为6.0左右,后者为4.0左右),淀粉原料的水解在传统工业中一般分为液化和糖化2个阶段进行,不仅使生产成本因工艺复杂、能耗高而增加,而且影响

[2]

液化糖化效果,直接影响下游产品质量。而耐酸性α2淀粉酶由于能在酸性条件下保持高活性,不仅可以简化液化、糖化过程,降低淀粉深加工的

[3]

生产成本。还可用于高麦芽糖浆的生产、开发

[4]

新型助消化剂以及工业废液处理等多个领域,

　收稿日期:2006-01-23

[1]

因此具有巨大的应用前景。国外对耐酸性α2淀粉酶的研究起步比较早,1963年日本的研究者YasujiMinoda等人就发现可用真菌生产耐酸性α2淀粉酶,以后欧洲、美国、韩国等国家都对耐酸性а2淀粉酶进行了研究,其中得到的产耐酸性а2淀

[5]

粉酶的微生物大多为芽胞杆菌和曲霉。我国开展相关研究起步较晚,目前主要集中在菌种选育

[6]

和构建基因工程菌等方面。本研究通过对大量样本进行筛选,从黄酒酒曲中分离得到一株野生菌株Tx278,经鉴定为黑曲霉(Aspergillusniger)。通过对Tx278进行紫外线诱变和亚硝基胍诱变,使其产酶能力比出发菌提高了86.7%,达到了1120U/mL。

1　材料与方法

1.1　材料

　作者简介:李勃　男,硕士生。主要从事工业微生物菌种改良及新菌种选育研究。　项目来源:陕西省科学技术研究发展计划项目[2005K08-G7-(1)]

4期　　　　　　　　　　　　　　　李勃等:耐酸性α2淀粉酶高产菌株的选育　　　　　47

1.1.1　样品来源　淀粉厂内酸性土壤,酒糟,醋

菌体和孢子充分搅匀,过滤掉菌丝后,稀释孢子浓度至约为10个/mL,作为待处理的孢子悬液;②紫外线诱变:具体方法参照文献[9]。取上述孢子悬液5mL,倾入直径为9cm的底部平整的培养皿中,在磁力搅拌器缓慢搅拌的条件下,置紫外垂直距离30cm处照射8、11、13min,稀释至适当梯度,取0.1mL涂布于筛选平板,30℃避光培养72h,统计诱变率与致死率,挑取单菌落接种斜面培养作发酵产酶实验;③亚硝基胍诱变:具体方法参照文献[10]。经紫外线诱变得到的高产菌株于斜面上30℃培养48h,用pH6.0的磷酸缓冲液配制孢子悬液,具体方法同上。取孢子

悬液5mL,加5mLNG(0.2%),分别处理15、30、45min后,稀释至10终止反应。取0.1mL

-3

8

醅,酒曲,窖泥。

1.1.2　培养基(质量分数,%)　①筛选培养基:(NH4)2SO40.25,KH2PO40.3,无水CaCl20.025,玉米淀粉1,蛋白胨0.5,琼脂2.5,pH3.5～4.5;②种子培养基:(NH4)2SO40.25,KH2PO40.3,无水CaCl20.025,玉米淀粉1,蛋白胨0.5,pH4.0;③发酵培养基:(NH4)2SO40.25,KH2PO40.3,无水CaCl20.025,玉米淀粉0.25,蛋白胨0.5,pH4.0。1.2　方法1.2.1　耐酸性α2淀粉酶生产菌株的筛选　称取样本5g加入装有50mL无菌水的小三角瓶中,震荡均匀后,做浓度梯度稀释,得到不同稀释度的样本溶液。将其涂布筛选培养基上,于33℃下进行培养。待菌体长出后,在平板表面喷洒稀碘液,将有透明圈的菌落挑出,进一步分离纯化。1.2.2　酶活的测定方法　①使用试剂:a.缓冲液:pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液;b.底物溶液:2%可溶性淀粉溶液,用缓冲液将其调至pH4.0;c.碘液:称取碘0.5g,KI5.0g,研磨溶于50mL蒸馏水中,定容至1000mL;②实验方法:取10mL底物溶液于60℃预热10min,加入1mL发酵液,摇匀,准确保温10min。用0.1mol/LHCl终止反应。取0.5mL反应液与10mL

涂布于筛选培养基上,30℃培养72h,计算致死率,挑取单菌落接种斜面培养作发酵产酶实验。

碘液显色,于660nm处测定吸光度。以磷酸氢二钠2柠檬酸缓冲液(pH4.0)作为空白参比液;③淀粉梯度标准曲线的绘制:分别配制浓度为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%的底物溶液。以同样方法进

图1　淀粉浓度标准曲线

Fig.1　Thestarchconcentrationstandardcurve

行吸光度测定,但不加发酵液而代之以1.0mL的蒸馏水。以淀粉浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准曲线,如图1所示。根据淀粉梯度标准曲线对照得到反应液的淀粉浓度后计算发酵液的酶活力。酶活力单位定义:在60℃、pH4.0条件下,10min液化1mg可溶性淀粉,即为1个酶活力单位,以U/g(U/mL)表示。

[7]

1.2.3　菌种鉴定　主要按《微生物分类学》中的方法进行鉴定,并根据《真菌鉴定手册》得到结果。

1.2.4　菌种诱变　①菌液制备:将10mL无菌

[8]

2　结　果

2.1　耐酸性α2淀粉酶生产菌株的筛选

2.1.1　菌种的筛选　从酸性土壤、酒曲、酒糟、醋

醅、窖泥中分离得到芽胞杆菌、长杆菌、放线菌、曲

霉、青霉等。经过复筛,其中有6株产酶较高(如表1所示),根据产酶情况以及菌种生长特性进行选择。由于黑曲酶Tx278产酶量高且营养要求简单,生长迅速,安全无毒害,便于应用于以后的工业化生产。因此,选用Tx278作为诱变出发菌株。

水注入培养48h的出发菌株斜面上,用接种环将

48　　　　　　　　　微　生　物　学　杂　志　　　　　　　　　　　　　　　　　27卷

表1　菌种筛选结果

Table1　Thestrainsscreenedresult

菌株编号

Tx8Tx12Tx36Tx78Tx79Tx83

鉴定结果枯草芽胞杆菌产黄青霉地衣芽胞杆菌黑曲霉黑曲霉枯草芽胞杆菌

产酶量/(U・mL-1)

90.2251.5602258.153.8

图2　Tx278菌株的菌落特征Fig.2　ColonycharacteristicsofstrainTx278

2.1.2　菌种鉴定　从黄酒酒曲中分离筛选到产耐酸性α2淀粉酶的野生菌株Tx278,并对其进行了鉴定。菌落形态:圆形、有褶皱,边缘为全缘、外观呈绒毛状。菌丝为白色,幼时有鲜黄色区域,培养基上产生明显透明圈(见图2)。

菌体特征:菌丝有横隔,分生孢子梗从足细胞垂直生出,无横隔(见图32a)。顶部泡囊呈球状,泡囊顶部生双层小梗,分生孢子串生于小梗顶部,呈辐射状排列,分生孢子为黑色,表面粗糙,直径小于5μm(见图32b)。

图3　Tx278菌株显微照片

Fig.3　StrainTx278underopticalmicroscopea:足细胞与分生孢子梗;b:分生孢子及泡囊

a:Footcellandconidiophore;b:Conidiumandconidiosporangium

　　鉴定结果:根据《真菌鉴定手册》和《微生物

分类学》的相关内容,鉴定此菌株为丛梗孢科(Moniliacene)、曲霉属(Asperigillus)、黑曲霉(ni2ger)。2.2　紫外线诱变结果

表2　紫外诱变结果

Table2　TheeffectofUVmutagenize

以野生菌株Tx278为出发菌株,进行不同时间的

紫外照射,诱变结果如表2所示。从表2中可以看出,照射11min时正变率较高,其中UV7835产酶量可达785U/mL,较出发菌提高30.8%。2.3　亚硝基胍(NG)诱变结果

表3　NG诱变结果

Table3　TheeffectofNGmutagenize

照射时间

/min8

致死率挑菌数正变率

/%90.10

/株28

/%20.1

菌株产酶量

/(U・mL-1)

照射时间致死率挑菌数

/min15

/%90.01

/株22

正变率

/%18.2

菌株产酶量

/(U・mL-1)

UV783UV788UV7816

6706857527267857146692

UN78358UN783514UN783519UN783520

11209969399249681004955962

1197.372625.4UV7829UV7835UV7840

3045

96.6398.24

1412

12.810.3

UN783520UN783520UN783520UN783520

1398.702012.5UV78UV7875

4期　　　　　　　　　　　　　　　李勃等:耐酸性α2淀粉酶高产菌株的选育　　　　　49

以UV78358作为出发菌株进行NG诱变,处理不同时间,其结果如表3所示。通过NG诱变,得到突变株UN78358,其产酶量可达1120U/mL,较出发菌株提高了86.7%。

2.4　遗传稳定性实验

为了观察UN78358的遗传稳定性,将其在斜面培养基上连续传代10次,每次接种进行摇瓶发酵,并测定其产酶量。结果见表4。

表4　遗传稳定性实验

Table4　GeneticstabilitytestofUN78358

传代次数产酶量/(U・mL-1)标准差变异系数

11124

21110

31106

411225112561107711208112691112

101123

7.590.0068

　　由表4可以看出,经过10次传代,UN78358产

酶量基本一致,说明该菌株遗传性能比较稳定。组正积极进行发酵工艺的改进以及构建基因工程菌等相关研究工作,希望能够早日实现该类新型酶制剂在国内的生产。参考文献:

[1]　韩萍,魏云林.α2淀粉酶低温适应性分子机制的研究进展

[J].微生物学杂志,2006,26(4):77.

[2]　刘春莉.特殊α2淀粉酶的应用现状和前景展望[J].四川食

3　讨　论

3.1　诱变

紫外线是一种应用广泛的微生物诱变剂,其

诱变频率高,是微生物育种中较为常用且有效的方法之一。但从实验效果来看,Tx278对于紫外线有很强的耐受能力,其诱变效果也并不显著,提高产量最高仅为30%左右。

亚硝基胍(NG)属烷化剂类的化学诱变剂,可以在pH6.0的条件下和DNA发生烷化作用引起突变。从实验效果来看,亚硝基胍对于Tx278的诱变作用较为显著,其产量提高较出发菌株提高可达86.7%,但正变率偏低,因此还应对该方法进一步改进。3.2　菌种选育

黑曲霉是最早发现能够产耐酸性α2淀粉酶的菌株,在日本、欧洲等国已经有用其进行工业化应用的报到。本实验选育的黑曲霉Tx278具有产酶量高,生长迅速,营养条件单一,生产安全等特点,便于今后的生产和应用。虽然目前该酶的发酵产量与工业化生产还存在一定差距,但本研究

品与发酵,2002,113(38):125.

α2[3]　WilkinsonStephen,JohnStevens,etal.Purifiedacid2stable

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