实验一 植物愈伤组织诱导培养基的配制
一、实验目的
1、掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理。
2、培养基的配制，灭菌等基本实验操作技术。
二、实验原理
植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够、增殖、分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞素的比例，决定了根和芽的分化。
三、仪器试剂
培养皿及培养架、光照培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、解剖刀、弯头镊子、剪子、100ml烧杯、培养皿（或不锈钢浅盘）、封口膜、棉线、橡皮筋、次氯酸钠（或HgCl2）、MS培养基全部试剂、植物激素及生长调节物质、无水乙醇、工业酒精、胡萝卜
四、实验步骤
1、培养基的制备
①用于配制培养基的水最好是三蒸水。
②所用的各种化学药品：分析纯级别的试剂，避免药品的交叉污染和混杂。
③配制培养基最方便的方法是预先配制好不同组分的培养基母液，存放在2～4℃冰箱内，使用时按比例稀释配用即可。
母液 化合物 NH4NO3 KNO3 KH2PO4 CaCl2·2H2O ZnSO4·7H2O 含量mg/L 1650 1900 170 440 8.6 编号 浓度mg/ml 33 38 3.4 7.4 2 3 8.8 0.86 2.23 0.62 称量mg 16500 19000 1700 3700 4400 430 1115 310 500 500 配制量ml 母液吸取量ml/L 1 500 50 MgSO4·7H2O 370 50 10 MnSO4·4H2O 22.3 H3BO3 6.2 2、MS培养
基的制备
①按照配方配制培养基时,先将储存母液按顺序摆放好，根据欲配制的总体积，量取各种不同体积的母液，加入2，4-D(2mg/L)，先加三蒸水至大约400ml。
②称取加入蔗糖(浓度3%)，调节pH至5.7-5.8。
③加入琼脂（8-9g/L）加热搅拌溶解，沸腾后立即端离火源（第一个大气泡从缸底上升顶破泡沫层），分装在100ml的三角培养瓶中（一般以容器的1/3～1/4体积为宜），拧紧瓶盖。
（培养基的pH值直接影响培养物对离子的吸收，过酸或过碱不仅影响到培养材料的生长，而且还影响到琼脂的凝固。
经高压高温灭菌后，由于某些成分的降解或氧化，酸度会增加（pH值一般可降低0.2），因此调整pH值时应加以考虑。）
3、灭菌
放入高压蒸汽灭菌锅灭菌，1.1kg·cm-2，121℃保持15～20分钟即可。为保证灭菌彻底，在增压前应先将灭菌锅内的冷空气排尽，当灭菌完成后，应切断热源，待锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，将余气放尽，再打开灭菌锅。
4、培养基的存放
经高压灭菌的培养基凝固后，宜放在培养室中预培养3～5天，若没有污染才可使用。暂时不用的培养基应放置在10℃以下保存，而含有生长调节物质的培养基则在4～5℃低温下保存更好。
5、植物愈伤组织诱导培养基的制备
1、每2人一小组，自由组合，固定。每5小组为1中组
2、MS培养基的配制
a、母液的配制（已准备好）
b、 培养瓶洗刷（每人一个）
c、每中组配制500mlMS培养基，（含琼脂4.5g，蔗糖15g，2,4-D母液1ml），调节PH，分装，灭菌
3、每人准备100ml/瓶去离子水→灭菌（无菌水)
4、每人100ml烧杯/试剂瓶→灭菌（无菌烧杯）
5、每2人一套平板，清洗，灭菌
每一中组的同学分工合作完成上述工作
五、实验结果
MS培养基植被完成。植物组织培养前期准备完成。
六、思考题
注意事项：
1、实验过程中保持安静
2、不浪费
3、学会试剂的配制，母液的稀释等
4、提前预习实验
5、所有的东西都要即时标记好，日期，名称，浓度等(标注可以组别-姓名，如1-姓名或1-姓名单字母缩写）
6、自己用过的器皿要自己洗刷，并灭菌，以备下组同学使用。
7、实验结束后用过的仪器等恢复原样，清洁实验台面，一切东西归位，每天最后一组同学统一打扫卫生。
思考题：
1、培养基配制应注意哪些问题？
答：1、试剂称取时要准确；2、不要浪费；3、注意调节pH；4、器皿要清洗干净；5、培养基分瓶时要及时否则会凝固。
2、培养基灭菌冷却后不凝固，请分析原因并提出解决办法。
答：1、琼脂浓度太低。解决方法：继续加热，加入少量琼脂，溶解即可。
2、pH值过酸性或过碱性。解决方法：测pH值，加入适量调节试剂，是pH在5.7~5.8之间。
