利用SerialEM进行单颗粒数据收集的流程-中国科学院生物

1 设置SerialEM各模式的放大倍数和dose rate

关闭FEI界面中的low dose。在数据收集放大倍数下，按电镜面板中的Eucentric focus键，将物镜电流归中(obj len: Titan为79.61％， Talos为85.6750％)。完成电镜合轴（rotation center和coma-free）、消像散后，如果是Titan Krios，需先选择并插入Falcon2相机后，再启动SerialEM。勾选SerialEM的Low Dose Control中的Low Dose Mode选项（1）。

放下电镜荧光屏，依次选择图中Area to show when screen down（2）中的Vie.，Foc.，Tri.，Rec.，查看放大倍数，dose rate是否符合要求。其中，Low Dose Mode下的文本显示当前成像模式下的实际状态参数（3）。

View模式为低倍（2000-4000倍即可），低剂量（<0.1e/Å2/sec），用于搜索拍照位点。 Record模式是真正的数据收集模式，按照所需的pixel size选取适当的放大倍数，在根据具体的剂量要求通过电镜面板上的intensity旋钮，调整到合适的dose rate。

focus模式是SerialEM的聚焦模式，通常设置和Record模式倍数相同（4），光斑大小可以在充分覆盖相机的前提下适当缩小。

Trial模式是光斑自动居中模式，设置与focus模式一致即可。也可通过勾选Keep Focus and Trial identical选项（5）自动将Trial模式和focus模式设置成一致。

当修改了放大倍数或者intensity时，需要勾选continuous updata mag & beam（6），来更新状态，然后再取消勾选continuous updata mag & beam来保护当前状态不被修改。

（1） （3） （6）

（2）

（5） （4）

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2 设置SerialEM各模式的相机参数及曝光时间

点击Camera & Macro Controls中的Setup按钮。

弹出以下界面。通过选择Parameter set中的View，Focus，Trial，Record，来分别设置这四个状态的Exposure time和Binning值。通常View，Focus，Trial模式选用Binning 4，Exposure time < 1 sec（视图像反差而定，若图像发白，则减少曝光时间）。而Record模式通常选择Binning 1，Exposure time 在Talos时按需要填写；在Titan上若是用capture进行数据收集，则Exposure time > 1 sec （可选Binning 4以提高收集速度），若不用capture，则Binning 1，Exposure time按需要填写。

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3 设置自动拍地图

a）在SerialEM菜单栏navigator-> open打开navigator

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b）在Low Dose Control界面 -> Area to show when screen down -> 选择Vie.

放下电镜荧光屏，等待20 sec将自动进入View模式。

在这个模式下，移动样品到载网的网格的中心（即square的中心）。 点击Camera & Macro Controls界面中的View按钮，拍一张低倍照片。 点击Buffer Controls界面中的Save Active按钮，保存该张低倍照片。

如果此前没有打开的mrcs或st文件供存储该尺寸的小地图，则会跳出保存信息界面要求指定存储信息及存储位点。如果此前已有打开的mrcs或st文件则设定保存信息和位点的步骤将不会出现。这张低倍照片仅做为下一步大地图拍摄的定位使用。

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指定存储信息，按照图所示选择即可。

指定存储位置及文件名。如图起一个st为扩展名的文件名在电镜可存储临时文件的位

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置（Talos为supportPC的网盘data\\，Titan为E:\\SerialEM_Titan\\）。

c）在navigator窗口中点击New map按钮，上一步中拍摄的低倍照片将做为一个小地图，做为下一步大地图拍摄的定位使用

在navigator窗口将出现一个条目，代表上一步中保存的低倍照片（小地图）

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d）在navigator窗口中点击Add Points按钮（随即该按钮变为Stop Adding）。

然后在已保存的低倍照片（小地图）上点击左键，设置拍大地图前的聚焦位点（通常在碳膜上）。选定的点会自动在navigator窗口添加一个条目，并在照片上出现该点在navigator窗口中的序号。

在navigator窗口中点击Stop Adding按钮，并勾选Acquire和New file at group

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如果此前没有设定大地图的拍摄参数及存储位点，则在勾选了New file at group后弹出以下窗口。在此窗口中选择Montaged images -> OK。如此前已设定大地图的拍摄参数及存储位点，以下步骤将不会出现。

设置大地图拍摄参数：

如下图显示X方向拍摄4张，Y方向拍摄4张（可根据样品的实际载网的网格大小来设置）。

勾选Move stage instead of shifting image，则程序在拍大地图时使用stage移动方式而非image shift.

勾选Use View parameters in Low Dose mode，则程序在拍大地图时使用View模式，而非Record模式。

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设置大地图存储位点

命名大地图，建议使用字母＋数字.st（例：map01.st）的模式命名，此后的大地图将由程序自动根据这种模式命名。

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e）移动到下一个square，按照步骤b，c和d进行设置，直至所有需要进行数据收集的square都已完成标定。每个完成标定的square将有两个条目，一个是小地图（没有AG标记），一个是拍大地图前的聚焦点（有AG标记）。

保存navigator，SerialEM菜单navigator -> save

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f）按照设定自动拍摄大地图。

按Ctrl键 ＋ 鼠标左键点击macro 17，查看macro17的内容。适用于自动大地图拍摄的macro17应为：

RealingToNavItem 1 ＃移动样品台至所选的点

call Z_focus ＃通过改变z轴高度进行自动聚焦至正焦 MoveStage 0 0 -4.5 ＃自动欠焦-4.5um updateitemZ ＃更新当前点的z值

当macro17检查无误后，可用以下步骤开启自动地图拍摄。 SerialEM菜单 -> Navigator -> Acquire at Points ->

在Initial Actions after Moving Stage栏中，选择Run Macro #17 在Primary Task栏中，选择Acquire map image

 GO

若跳出此窗口，则选No。

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随后，所选定的所有点都将进行自动大地图拍摄。拍摄好的大地图条目的序号将带一个A，如2-A，4-A，6-A等。双击该条目可将拍好的大地图调出到buffer E中，显示到主界面上。

注意保存navigator。SerialEM菜单navigator -> save

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4 选择数据收集位点

在navigator窗口中点击Add Points按钮（随即该按钮变为Stop Adding）。

然后在大地图上点击左键，设置数据收集的位点。点击选定的点会自动在navigator窗口添加一个条目，并在照片上出现该点在navigator窗口中的序号。选择完成后，点击Stop Adding退出选择位点的状态。

Group是指从点击Add Points开始到点击Stop Adding结束的整个期间里，所选定的所有点。

请注意每个group的第一个位点为Focus位点（通常选择在碳膜上）。随后的其它位点为需要进行数据收集的位点。请注意每个group只在第一个Focus位点进行自动聚焦（只改变Z值，不改变obj lens），随后的其它点采用与Focus位点相同的Z值进行数据收集，不再聚焦。因此，每个group的点分布的范围不宜过大，通常1/1的支持膜内，4 * 4个孔的范围可为一个group。

group选择完成后，勾选Collapse groups选项时，可将同一个group中的所有点归至一个条目内。逐个选定每个group，勾选Acquire选项，让group内的每个点都带上标记A，在Collapse groups状态中，每个group带上All Acq标记。在Talos或者在Titan但不用capture进行数据收集时，还需勾选New file at group，以设定数据收集的存储位点，使每个数据收集位点条目带上AG标记。在Titan用capture进行数据收集时，不需要选择勾选New file at group，使每个数据收集位点条目只带A标记，因为capture会自动获取exposure time超过一秒的照片进行输出。

注意保存navigator。SerialEM菜单navigator -> save

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5 离线选择数据收集位点

为了缩短自动数据收集的设置时间，可在选择了少量点运行数据收集的同时，进行离线的选择数据收集位点。具体步骤如下：

a）将自动拍摄好的所有大地图文件（map*.st）和自动拍摄完大地图后保存的nav文件（nav.nav），拷贝到supportPC上。

b）启动supportPC上的SerialEM-offline。

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c）在离线版的SerialEM中打开拷贝过来的nav文件（nav.nav）。

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d）在navigator窗口中点击Add Points按钮（随即该按钮变为Stop Adding）。

然后在大地图上点击左键，设置数据收集的位点。点击选定的点会自动在navigator窗口添加一个条目，并在照片上出现该点在navigator窗口中的序号。选择完成后，点击Stop Adding退出选择位点的状态。

Group是指从点击Add Points开始到点击Stop Adding结束的整个期间里，所选定的所有点。

请注意每个group的第一个位点为Focus位点（通常选择在碳膜上）。随后的其它位点为需要进行数据收集的位点。请注意每个group只在第一个Focus位点进行自动聚焦（只改变Z值，不改变obj lens），随后的其它点采用与Focus位点相同的Z值进行数据收集，不再聚焦。因此，每个group的点分布的范围不宜过大，通常1/1的支持膜内，4 * 4个孔的范围可为一个group。

group选择完成后，勾选Collapse groups选项时，可将同一个group中的所有点归至一个条目内。逐个选定每个group，勾选Acquire选项，让group内的每个点都带上标记A，在Collapse groups状态中，每个group带上All Acq标记。在Talos或者在Titan但不用capture进行数据收集时，还需勾选New file at group，以设定数据收集的存储位点，使每个数据收集位点条目带上AG标记。在Titan用capture进行数据收集时，不需要选择勾选New file at group，使每个数据收集位点条目只带A标记，因为capture会自动获取exposure time超过一秒的照片进行输出。

注意保存navigator。SerialEM菜单navigator -> save as -> nav01.nav （与第一个nav文件不一样的名字）。

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e）当所有大地图都已经选点结束，可在SerialEM的在线运行版本上停止正在进行的数据收集，将离线版选择的点merge到在线版的navigator中。具体步骤如下：

SerialEM在线版菜单 -> Navigator -> Merge File -> 选择离线版最后保存的nav文件（文件名与在线版当前文件名不同）

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6 启动自动数据收集

按Ctrl键 ＋ 鼠标左键点击macro 20，查看macro20的内容。适用于自动数据收集的的macro20应为：

#For Titan Krios with capture

GroupSize = 50 ＃根据实际每个group中的点的大致个数进行修改 MinDefocus = -2.5 ＃欠焦最小值（-2 适用于最小欠焦为-1um） MaxDefocus = -3.5 ＃欠焦最大值（-3.5 适用于最大欠焦为-5um） Step = 10 Loop 10

AreDewarsFilling

Filling = $reportedValue1 If $Filling == 0 Break Endif

Delay 5 min EndLoop

ReportGroupStatus GS = $reportedValue1 RealignToNavItem 1 If $GS == 1

ReportNavItem

TargetIndex = $reportedValue1

GroupIndex = $TargetIndex / $GroupSize TargetStep = $GroupIndex Loop 10000

If $TargetStep < $Step Break Endif

TargetStep = $TargetStep - $Step EndLoop

FocusRange = $MaxDefocus - $MinDefocus

TargetDefocus = $MinDefocus + $FocusRange / $Step * $TargetStep

GoToLowDoseArea F ScreenDown Delay 20 ScreenUp Call Z_focus

MoveStage 0 0 $TargetDefocus UpdateGroupZ Else

ResetImageShift Delay 15 R Endif

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#For Talos and Titan without capture

GroupSize = 50 ＃ 根据实际每个group中的点的大致个数进行修改 MinDefocus = -2.5 ＃欠焦最小值（-2 适用于最小欠焦为-1um） MaxDefocus = -3.5 ＃欠焦最大值（-3.5 适用于最大欠焦为-5um） Step = 10

Loop 10 ＃Talos可不要 AreDewarsFilling ＃Talos可不要 Filling = $reportedValue1 ＃Talos可不要 If $Filling == 0 ＃Talos可不要 Break ＃Talos可不要 Endif ＃Talos可不要 Delay 5 min ＃Talos可不要 EndLoop ＃Talos可不要 ReportGroupStatus GS = $reportedValue1 RealignToNavItem 1 If $GS == 1

ReportNavItem

TargetIndex = $reportedValue1

GroupIndex = $TargetIndex / $GroupSize TargetStep = $GroupIndex Loop 10000

If $TargetStep < $Step Break Endif

TargetStep = $TargetStep - $Step EndLoop

FocusRange = $MaxDefocus - $MinDefocus

TargetDefocus = $MinDefocus + $FocusRange / $Step * $TargetStep

GoToLowDoseArea F ScreenDown Delay 20 ScreenUp Call Z_focus

MoveStage 0 0 $TargetDefocus UpdateGroupZ Else

ResetImageShift

Delay 15 #指样品台移动到拍照位点后停滞时间15秒，该数值可依据实际情况修改

R S Endif

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此外，这两个macro以及之前的自动大地图拍摄都引用一个叫Z_focus的macro，按Ctrl键 ＋ 鼠标左键点击Z_focus，查看Z_focus的内容如下：

MacroName Z_focus Loop 2

Autofocus -1

ReportAutofocus

t = -1 * $reportedValue1 MoveStage 0 0 $t

echo --> Z moved $reportedValue1 micron EndLoop

当检查以上macro都无误后，在Titan Krios用capture收集的，按capture的步骤进行扣相机背底和启动capture的操作。

确认相机设置无误（参照步骤2）后，确认“Low dose control”界面Area to show when screen down选择Rec. 或者Foc.模式，以上设置无误后，启动自动数据收集。

SerialEM菜单 -> Acquire at Points ->

在Initial Actions after Moving Stage栏中，不选择任何选项 在Primary Task栏中，选择Run Macro ＃ 20  GO

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7 停止自动数据收集

实验结束或是需要为低温杆加注液氮时，需要停止数据收集。当看到SerialEM主界面右下角状态显示的最后两项均无操作（显示内容为空白），即可进行自动数据收集停止的操作。

无状态显示 无状态显示

1.点击Camera & Macro Controls中的Stop按钮。

2.紧接着，点击End Mac按钮

3.紧接着，再点击Stop按钮

4.当三个按钮均为灰色不可点状态，则自动数据收集完全停止

此时SerialEM主界面右下角状态显示栏内容均为空，如下图所示：

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8 暂停后重启自动数据收集

如若是实验中因故暂停了数据收集（如，为液氮罐加注液氮等），之后需要继续收集数据，则需要重启自动收集程序，步骤如下：

1.在Navigator中找到并选中自动数据收集暂停点Group，该条目后显示为Some Acq

2.取消勾选Navigator中Collapse groups，展开当前Group，默认自动选中该Group内第一个点（每个group的第一个位点为Focus位点），若该点条目后面没有A，则需要勾选Navigator中的Aquire使条目后出现A字样，如下图所示：

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3.设置完成后，保存Navigator，点击Aquire at points重新启动自动数据收集。

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