荧光分光光度计与紫外可见分光光度计在结构上存在显著差异。荧光分光光度计配备有两个单色器，相较于一般紫外可见分光光度计的单一单色器，具备更高分辨率和分析能力。
在光源与检测器的布置上，荧光分光光度计将两者设置为直角分布，这有助于有效分离和检测荧光信号，而紫外可见分光光度计则采用线性分布，简化了光学系统设计。
光源的选择也是两者的关键区别之一。荧光分光光度计通常采用氙灯作为光源，能提供广泛的光谱范围，适用于荧光分析。而紫外可见分光光度计则分别以氘灯作为紫外区光源和钨灯或卤钨灯作为可见光区光源，确保了在特定波段的高精度测量。
在比色皿设计上，荧光分光光度计的比色皿具有四壁为光学面的特性，能够更准确地捕获和检测荧光信号，而紫外可见分光光度计的比色皿仅具备两面为光学面，适应于一般光谱分析需求。
